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.2010年2月19日；285(8):5428-37.
doi:10.1074/jbc。M109.035295。 Epub 2009年12月17日。

DDX5 S480A多态性与肝星状细胞纤维化基因转录增加相关

郭金生 1, 冯红, 约翰尼·洛克, 史蒂文是的, Chooi Ling Lim公司, 乌苏拉·李, 德里克·阿曼, 马丁·沃尔什, 约翰·斯宁斯基, 斯科特·弗里德曼
附属公司

DDX5 S480A多态性与肝星状细胞中纤维化基因转录增加有关

郭金生等。 生物化学杂志. .

摘要

我们最近在DDX5（rs1140409，p.S480A）中发现了一种错义单核苷酸多态性（SNP），它增加了发展为肝硬化的风险。DDX5是一种依赖ATP的RNA解旋酶和转录调节剂。我们假设，S480A SNP改变了DDX5在肝星状细胞（HSC）中调节纤维化基因转录的活性。为了验证这一点，我们采用了两种方法：1）DDX5 cDNA的瞬时过表达或内源性DDX5的siRNA敲除，替换为DDX5野生型（WT）或SNP cDNA，或2）HSC株系中外源性DDX5WT和SNP的稳定表达。HSC中WT DDX5 mRNA与α2（I）胶原、金属蛋白酶组织抑制剂-1和转化生长因子-beta1的基因表达呈负相关。稳定的DDX5 SNP表达细胞具有较高的基础生长因子和转化生长因子β1刺激的表达，并增强了成纤维基因的启动子活性。DDX5差异表达细胞也具有较高的Smad3和AP-1反应性报告活性。在一个单杂交GAL4系统中，DDX5 SNP变异体与连接到JunD或Sp1的GAL4 DNA结合域嵌合体的共同表达显示GAL4应答报告子的反式激活高于DDX5 WT。DDX5 SNP表达细胞中纤维生成基因表达的增加与DDX5同型二聚体向应答启动子的募集减少相关，但联合阻遏物HDAC1（组蛋白去乙酰化酶1）的募集没有差异。这些数据表明，DDX5通过与转录复合物的相互作用，是HSC中纤维生成基因的阻遏物。DDX5风险变异体的纤维生成活性增强与对这些靶基因的抑制功能降低有关。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
在LX-2和原代人HSC中，siRNA敲低DDX5后，TGF-β1、α-SMA和α2（I）胶原mRNA表达增加。 A类，LX-2细胞需要血清24小时，然后在平行培养中转染针对DDX5的隐形siRNA®双体或非靶向siRNA对照12小时，最终浓度均为100 m米然后将细胞培养在1%胎牛血清补充的Dulbecco改良Eagle’s培养基中，分别于12、24和48 h收获，然后进行TGF-β1、α-SMA和α2（I）胶原mRNA水平的实时PCR分析。结果显示为至少三个独立实验（*，第页< 0.05; **,第页与对照siRNA治疗组相比<0.01）。B类，第4代的原代人HSC也转染了相同的DDX5 siRNA，并将非靶向siRNA作为对照（100 m米). 细胞处理与LX-2分析相同A类并在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。通过实时PCR定量mRNA表达。结果显示为至少三个独立实验（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01).C类，用非靶向对照siRNA转染LX-2细胞(CsiRNA)或针对DDX5的siRNA(小干扰RNA)血清饥饿24h后12h，分别于12h、24h和48h采集细胞，用DDX5、α-SMA、I型胶原进行Western blotting分析(第一列)和TGF-β1抗体。当DDX5被击倒时，他们的表达显著增加(小干扰RNA)与非靶向siRNA相比(CsiRNA)-处理的对照细胞。
图2。
图2。
用DDX5 SNP变体重建的LX-2细胞具有较高的I型胶原和α-SMA表达。将DDX5 5′-非翻译区的siRNA转染到LX-2细胞中，以降低内源性DDX5 mRNA的表达。然后用表达DDX5 WT或SNP的cDNA转染细胞以重建表达。24小时后对细胞进行裂解，并通过Western blot分析DDX5、α-SMA和I型胶原。使用β-肌动蛋白作为蛋白质负荷对照。siRNA-转染细胞显示内源性DDX5显著减少，而通过转染重建的细胞恢复了DDX5野生型的表达(小干扰RNA+重量)或含有SNP(小干扰RNA+SNP公司)蛋白质水平相等。用DDX5 SNP蛋白重组的LX-2细胞中α-SMA和I型胶原的表达高于用DDX5WT重组的细胞。该结果具有三个独立实验的代表性。
图3。
图3。
外源DDX5在LX-2系中的表达。利用免疫荧光、DAPI核染色和抗FLAG M2-荧光素异硫氰酸盐单克隆抗体，在稳定转染DDX5 WT的LX-2细胞中检测到外源性DDX5蛋白表达(a–c)或SNP(d–f日)cDNA，但不在转染LacZ表达控制载体的细胞中(g–i). DDX5定位于核周和细胞核。
图4。
图4。
DDX5 SNP对LX-2细胞中I型胶原、TIMP-1和TGF-β1蛋白表达的影响。 A类，I型胶原蛋白的Western blot(第一列)和细胞裂解物中的TGF-β1。B类对稳定转染DDX5 WT和SNP以及对照LacZ cDNA（有或无TGF-β刺激）的LX-2细胞培养上清液中TIMP-1蛋白水平进行酶联免疫吸附测定。DDX5 SNP表达细胞具有较高的基础基因和TGF-β1刺激的细胞产生这些关键的成纤维基因。每个柱表示的平均值±S.En个=在三个独立实验中每组6个。*，第页与未经TGF-β1处理的对照细胞相比，<0.05。#，第页与DDX5 WT表达细胞相比，<0.01。
图5。
图5。
DDX5 SNP对LX-2细胞中α2（I）胶原、TIMP-1和TGF-β1基因启动子活性的影响。显示的是启动子活性（以相对轻单位表示(RLU（RLU）))α2（I）胶原蛋白(A类)、TIMP-1(B类)，转化生长因子-β1(C类)在细胞内裂解。用DDX5 WT和SNP稳定转染LX-2细胞，并在有或无TGF-β1刺激的情况下控制LacZ cDNA。每个柱表示的平均值±S.En个=在三个独立实验中每组6个。DDX5 WT-和SNP表达细胞之间的差异显著。*，第页与未经TGF-β1处理的对照细胞相比，第页与DDX5 WT表达细胞相比，<0.01。¥,第页与LacZ cDNA转染的对照细胞相比，<0.05。在不存在或存在TGF-β1的情况下，表达LacZ和SNP的细胞之间的差异也很显著(第页< 0.01; 图中未包含表示这些差异的符号）。
图6。
图6。
DDX5单核苷酸多态性对LX-2细胞Smad3和AP-1反应性报告活性的影响。所示为Smad3-responsive报告员的活动(A类)和AP-1反应型报告员(B类)在有或无TGF-β1刺激的LacZ-、DDX5 WT-或SNP-表达细胞中。DDX5 SNP表达细胞比WT DDX5表达细胞（以相对光单位表达(RLU（RLU）)). 每个柱表示的平均值±S.En个=在三个独立实验中每组6个。*，第页与未经TGF-β1处理的对照细胞相比，<0.01。#，第页与DDX5 WT表达细胞相比，<0.01。¥,第页与LacZ cDNA转染的对照细胞相比，<0.01。
图7。
图7。
DDX5 SNP赋予GAL4响应型报告者更大的交易动机。用DDX5 SNP cDNA共转染LX-2细胞和表达Sp1融合蛋白的载体(A类)或JunD(B类)与GAL4-DBD相关联的GAL4-responsive TATA荧光素酶报告子的反式激活率高于转染DDX5 WT cDNA的细胞。每个柱表示平均值±S.E.（表示为相对光单位(RLU（RLU）))第页，共页n个=在三个独立实验中每组6个。#，第页与DDX5 WT cDNA转染细胞相比，<0.01。¥,第页与LacZ cDNA转染的对照细胞相比，<0.01。
图8。
图8。
DDX5 WT和SNP均与HDAC1相互作用，形成核同二聚体。用等量的GAL4和FLAG融合DDX5 WT或SNP cDNA表达质粒共同转染LX-2细胞。用抗FLAG M2单克隆抗体免疫沉淀核蛋白，并用GAL4-DBD或HDAC1抗体印迹。HDAC1与DDX5 WT或DDX5 SNP之间存在类似的相互作用。相反，在仅转染DDX5 SNP cDNA的细胞中检测到较少的同二聚体复合物(SNP-SNP公司)或DDX5 WT和SNP cDNA(WT-SNP公司)与那些单独表达WT cDNA（WT-WT）的人相比。非相关正常血清用作阴性对照(控制). 这个数字代表了三个独立的实验，它们都产生了类似的结果。GAPDH公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
图9。
图9。
含DDX5 SNP的同型二聚体与α2（I）胶原、TIMP-1和TGF-β1启动子区的相互作用减少。用相同数量的GAL4和FLAG标记的DDX5 WT或SNP cDNA表达质粒共同转染LX-2细胞。ChIP使用抗FLAG M2抗体分析DDX5 WT或SNP同二聚体或其与HDAC1的复合物在α2（I）-胶原、TIMP-1和TGF-β1启动子上的结合，然后用GAL4-DBD或HDAC1抗体重新沉淀，然后PCR扩增。非特异性IgG用作阴性对照(控制). 与DDX5 WT相比，DDX5 SNP蛋白同二聚体与三个启动子的结合减少。DDX5 WM或SNP与HDAC1在启动子区域的相互作用相似。这个数字代表了三个独立的实验，它们都产生了类似的结果。
图10。
图10。
用SNP蛋白替代DDX5 WT可消除DDX5 WM对成纤维基因活性的抑制作用。LX-2细胞被镀成48个板。在每个孔中，共有0.8μg不同比率（0.8:0、0.6:0.2、0.4:0.4、0.2:0.6和0:08）的DDX5 WT和SNP cDNA或LacZ对照载体与0.2μgα2（I）胶原、TIMP-1或TGF-β1的启动子荧光素酶报告质粒共转染。测定细胞的启动子萤光素酶活性（以相对光单位表示(RLU（RLU）))转染后24小时。引入含有逐渐增多的DDX5 SNP而不是DDX5 WT的cDNA组合，逐渐消除了DDX5 WM对启动子活性的抑制作用。每个酒吧表示的平均值±S.En个=在三个独立实验中每组8个。*，第页与0.8μg WT cDNA转染细胞相比，<0.05。¥,第页与LacZ cDNA转染的对照细胞相比，<0.01。
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    1. Friedman S.L.（2008）胃肠病学134、1655–1669-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Wise M.、Bialek S.、Finelli L.、Bell B.P.、Sorvillo F.（2008）《肝病学》47、1128–1135-公共医学
    1. Bataller R.、North K.E.、Brenner D.A.（2003）《肝病学》37、493–503-公共医学
    1. Huang H.、Shiffman M.L.、Friedman S.、Venkatesh R.、Bzowej N.、Abar O.T.、Rowland C.M.、Catanese J.、Leong D.U.、Sninsky J.、Layden T.J.、Wright T.L.和White T.、Cheung R.C.（2007）《肝病学》46、297–306-公共医学
    1. Hellier S.、Frodsham A.J.、Hennig B.J.、Klenerman P.、Knapp S.、Ramley P.、Satsangi J.、Wright M.、Zhang L.、Thomas H.C.、Thursz M.、Hill A.V.（2003）《肝病学》38、1468–1476-公共医学

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