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.2010年5月-6月；52(5-6):182-90.
doi:10.1016/j.vph.2009.11.010。 Epub 2009年12月3日。

一氧化氮合酶解偶联在内毒素诱导急性肺损伤中的机制：不对称二甲基精氨酸的作用

施卢蒂·沙尔玛 1, 安妮塔·史密斯, 桑吉夫·库马尔, 索拉巴·阿加瓦尔, 伊姆兰·雷马尼, 康妮·斯奈德, 辛西娅·哈蒙, 杰弗里·芬曼, 大卫·富尔顿, 约翰·D·卡特拉瓦斯, 斯蒂芬·M·布莱克
附属公司

一氧化氮合酶解偶联在内毒素诱导急性肺损伤中的机制：不对称二甲基精氨酸的作用

施卢蒂·沙尔玛等。 血管药理学. 2010年5月-6月.

摘要

急性肺损伤（ALI）与肺结构和功能的严重改变有关，其特征是低氧血症、肺水肿、肺顺应性低和广泛的毛细血管渗漏。不对称二甲基精氨酸（ADMA）是一种已知的心血管危险因素，与内皮功能障碍和许多心血管疾病的发病机制有关。然而，ADMA在ALI发病机制中的作用尚不清楚。二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（DDAH）通过水解降解将ADMA代谢为l-瓜氨酸和二甲胺。最近的研究表明，脂多糖（LPS）显著增加内皮细胞中ADMA的水平并降低DDAH的活性。因此，本研究的目的是确定ADMA/DDAH通路的改变是否有助于小鼠LPS暴露引发的ALI的发展。我们的数据表明，LPS暴露显著增加ADMA水平，这与DDAH活性降低有关，但与DDAHI或DDAHII亚型的蛋白质水平无关。此外，我们发现ADMA水平的增加导致一氧化氮（NO（x））的早期减少，以及NO合成酶（NOS）衍生的超氧化物和总硝化肺蛋白的显著增加。最后，我们发现，用尿酸或锰（III）四（1-甲基-4-吡啶基）卟啉（MnTymPyp）降低过氧亚硝酸盐水平可显著减轻小鼠与LPS暴露相关的肺漏，表明蛋白质硝化在ALI进展中起关键作用。总之，这是首次研究表明ADMA/DDAH通路在小鼠ALI发生过程中发挥作用，并且ADMA可能是一种新的治疗性生物标记物，用于确定ALI发生的风险。

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数字

图1
图1
LPS暴露后小鼠肺中的超氧化物水平。通过电子顺磁共振（EPR）测定LPS处理小鼠肺中的相对超氧物水平。LPS暴露后2小时和4小时，超氧自由基生成显著增加，而NOS抑制剂NG-单甲基的加入阻止了超氧自由基生成L（左）-精氨酸（L-NMMA；100μM）或聚乙二醇超氧化物歧化酶（PEGSOD；100 U/ml）。LPS暴露12小时后，超氧化物生成没有变化。数值为平均值±SE，N=6*P（P）<0.05 vs.无LPS，†P（P）<0.05，仅与LPS相比。
图2
图2
肺组织NOx个LPS暴露后四氢生物蝶呤水平。组织NOx个LPS暴露2小时后，水平显著降低。然而，否x个LPS暴露后4小时和12小时水平显著升高（A）。肺BH4用HPLC测定含量。伯克希尔哈撒韦没有变化4LPS暴露后2小时的水平，但BH4LPS处理后4小时和12小时水平显著升高（B）。数值为平均值±SE，N个=每组5人*P（P）与无LPS相比<0.05，†P（P）与前一时间点相比<0.05。
图3
图3
LPS暴露后小鼠肺中NOS亚型蛋白水平。通过Western blot分析，分别使用针对eNOS、nNOS或iNOS的特异性抗血清，并用β-actin再表达，以恢复正常负荷，在LPS暴露后2-h和4-h测定肺组织中eNOS，nNOS和iNOS蛋白水平。eNOS（面板A）、nNOS（板B）和iNOS（盘C）的代表性蛋白质印迹显示。eNOS或nNOS蛋白水平没有变化，但iNOS蛋白在LPS暴露后4小时显著升高。数值为平均值±SE，N个每组=5*P（P）与无LPS相比，<0.05。
图4
图4
LPS暴露导致小鼠肺中ADMA升高和DDAH活性降低。采用高效液相色谱法（HPLC）分析LPS暴露后小鼠肺部ADMA水平和DDAH活性。暴露2、4和12小时LPS后，ADMA水平逐渐升高（a）。尽管DDAH I（B）或DDAH II（C）蛋白水平没有变化，但在LPS暴露后2小时和4小时，DDAH活性显著下降（面板D）。数值为平均值±SE，N个=每组5人*P（P）与无LPS相比，<0.05。
图5
图5
LPS暴露后，小鼠肺中的硝酸蛋白水平增加。LPS暴露4小时后，测定小鼠肺中总硝化蛋白的蛋白质水平。在4–20%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离同系物（25μg），电泳转移到PVDF-硝酸纤维素膜，并使用针对3-NT残基的特异抗血清进行分析。3-NT蛋白水平的Western blot分析的代表性图像如图（A）所示。方框区域显示了用于量化3-NT水平的总硝化蛋白区域。密度分析表明，LPS暴露增加了小鼠肺中的总硝化蛋白（B）。数值为平均值±SE，N个=5. *P（P）<0.05 vs.无LPS。
图6
图6
清除过氧亚硝酸盐可降低小鼠肺部LPS介导的高渗透性。在存在或不存在ONOO清除剂、尿酸和MnTymPyp的情况下，在LPS暴露4小时后测定小鼠肺中总硝化蛋白的蛋白质水平。与单独用LPS获得的总硝化蛋白水平相比，尿酸和MnTymPyp的存在显著降低了总硝化蛋白水平（A），并且这与肺中Evans蓝染料水平的显著降低相关，表明肺通透性降低（B）。数值为平均值±SE，N个=5. *P（P）<0.05 vs.无LPS，†P（P）<0.05，仅与LPS相比。
图7
图7
ADMA增强了人肺微血管内皮细胞中与VEGF暴露相关的跨内皮电阻（TER）降低。汇合物是否接触ADMA（5μM，1 h）。然后将细胞暴露于或不暴露于VEGF（100 ng），通过ECIS测量内皮细胞单层的TER变化。虽然ADMA本身不会引起TER的变化，但与VEGF暴露相关的TER的降低有增强作用。数值为平均值±SE，N个=5. *P（P）<0.05 vs.未治疗†P（P）与仅VEGF相比，<0.05。
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