Functional involvement of Tudor and dPRMT5 in the piRNA processing pathway in Drosophila germlines

doi:10.1038/emboj.2009.365

.2009年12月16日；28(24):3820-31.

doi:10.1038/emboj.2009.365。

Tudor和dPRMT5在果蝇种系piRNA加工途径中的功能参与

Kazumichi M Nishida公司¹, 冈田友子, 川村武, Toutai Mituyama公司, 川村吉行, 稻垣祯一, 黄海东, 陈大华, 佐田达彦, Haruhiko Siomi先生, 米基科·西奥米

附属公司

PMID： 19959991
PMCID公司： PMC2797066型
内政部： 10.1038/emboj.2009.365

Tudor和dPRMT5在果蝇种系piRNA加工途径中的功能参与

Kazumichi M Nishida公司等人。欧洲工商管理硕士J. 2009.

.2009年12月16日；28(24):3820-31.

doi:10.1038/emboj.2009.365。

作者

Kazumichi M Nishida公司¹, 冈田友子, 川村武, Toutai Mituyama公司, 河村吉诺里, 稻垣知一, 黄海东, 陈大华, 佐田达彦, Haruhiko Siomi先生, 米基科·西奥米

附属

¹日本东京庆应义塾大学医学院分子生物学系。

PMID： 19959991
PMCID公司： PMC2797066型
内政部： 10.1038/emboj.2009.365

摘要

在果蝇中，PIWI蛋白、茄子（Aub）、AGO3和PIWI在种系中表达，并通过与PIWI相互作用RNA（piRNAs）结合来沉默转座子。最近的研究表明，PIWI蛋白含有对称的二甲基精氨酸（sDMA），dPRMT5/Capsuleen/DART5是修饰酶。在这里，我们表明Tudor（Tud）是Tud结构域蛋白之一，通过其sDMA修饰与Aub和AGO3结合，并且这三种蛋白形成异聚复合物。在这些复合物中检测到piRNA前体样分子。Aub和AGO3的表达水平及其sDMA修饰程度未因tud突变而改变。然而，与Aub和AGO3相关的转座子衍生piRNAs的数量因tud突变而改变，而Aub和AGO3上的小RNA总量增加。dprmt5的缺失并没有改变Aub的稳定性，但削弱了其与Tud的结合，并降低了piRNA与Aub的结合。因此，在种系细胞中，piRNA由修饰PIWI蛋白的dPRMT5控制质量，与Tud紧密相关。

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数字

图1
Aub改性的LC-MS/MS分析。(A类)通过数据库搜索确定Aub肽。黄色背景的字母是搜索结果。绿色背景的表示经过修饰的氨基酸；其中，M、R和C分别表示蛋氨酸被氧化，精氨酸被sDMA氧化，半胱氨酸被氨基甲酰化。第一个蛋氨酸上的Ac表示该氨基酸是N-末端乙酰化的。(B类)Aub肽的MS光谱，从M1到R17（M1–R17；米/*z（z）*=501.5413，理论值=501.541）。(C类)Aub肽M1–R17的ETD MS/MS光谱。片段中的离子质量与Aub肽中的C离子的质量很好地匹配，范围从丙氨酸10到甘氨酸16（A10-G16）A-2meR-G-2meR-G-R，其中“2meR”表示sDMA修饰的精氨酸。天冬酰胺2到异亮氨酸10（N2–L9）区域的裂解峰未指定。

图2
Tud与sDMA-修饰Aub特别相关。(A类)使用对应于蛋氨酸1到天冬酰胺25（M1–N25）的Aub肽对卵巢裂解物进行下拉分析。肽序列如下图所示。“Aub肽”和“Aub-sDMA肽”分别在未经sDMA修饰的情况下和经过sDMA改性的情况下制备。红色的Rs表示sDMA修改的Rs。一种约280 kDa的显著蛋白质，与Aub-sDMA肽特异相关。MS分析显示该蛋白与Tud对应。(B类)与Aub肽相关的蛋白池中抗Tud抗体的Western blot分析(A类)证实了～280 kDa波段为Tud。两个蛋白池中均未检测到Spn-E。(C类)从wt和*数字电源模块5*使用抗Aub抗体的突变体。非免疫IgG（n.i.）用作阴性对照。然后用抗Tud、抗Aub和SYM11（一种特异识别sDMA修饰蛋白的抗体）检测免疫纯化复合物。Tud仅在从wt卵巢获得的Aub复合物中观察到。Aub输入*数字电源模块5*正如之前报道的那样，SYM11未检测到突变体（Kirino等人，2009年）。“输入”车道中标有星号的信号为背景信号。(D类)用抗Tud、抗Aub和抗AGO3抗体探测来自wt卵巢裂解物的抗Tud免疫纯化复合物。在复合物中同时检测到Aub和AGO3，这表明Tud与AGO3的sDMA依赖性结合。

图3
Tud与AGO3的sDMA依赖性关联。(A类)合成了两种AGO3肽，AGO3-1和AGO3-2，分别对应于蛋氨酸1到赖氨酸25（M1–K25）和苏氨酸58到组氨酸82（T58–H82），分别带有和不带有sDMA修饰，并从卵巢裂解物中进行下拉分析，如图2A所示。红色的Rs表示那些经过sDMA修改的Rs。用抗Tud和抗Spn-E抗体探测所获得的蛋白质池。在使用Aub-sDMA和AGO3-2-sDMA而不是AGO3-1-sDMA肽的下拉池中检测到了Tud的信号，但没有检测到Spn-E的信号，这表明AGO3区域T58–H82是Tud的结合域。(B类)用抗Aub和抗AGO3抗体探测与Aub、Aub-sDMA、AGO3-2和AGO3-2-sDMA肽结合的蛋白质。这两种蛋白都用sDMA肽进行了特异性检测。这些结果表明Tud能够同时与Aub和AGO3结合形成异聚物。(C类)用抗Tud、抗Aub和抗AGO3抗体探测来自wt卵巢裂解物的抗AGO3-免疫纯化复合物。

图4
Tud-Aub复合物中含有成熟的piRNA和piRNA前驱体样分子。(A类)使用抗Tud和抗Aub抗体从卵巢裂解物中提取免疫沉淀复合物，并用抗Tud抗体和抗Aub抗体进行检测。在进行western blot分析之前，将抗Aub免疫沉淀稀释为1:2.5、1:5和1:10。应注意，Aub复合物的～1:5稀释度使抗Tud和抗Aub免疫沉淀复合物中Aub的量相等。(B类)从抗Tud和抗Aub免疫沉淀复合物中分离的RNA分子用³²P-标记的DNA寡核苷酸识别鲁奥piRNAs（左右面板分别为反义和正义）。虽然～1:5稀释的Aub复合物使两种复合物中的Aub数量相等，但较低水平的Aub鲁奥在抗Tud免疫沉淀物中检测到piRNAs（左图），这表明Aub虽然与Tud结合，但与低水平的piRNA相关。用正反义探针在抗Tud免疫沉淀物中观察到了piRNA前体样信号（表示为前piRNA样）鲁奥在Tud-或Aub-免疫沉淀复合物中未检测到piRNAs（右）。我们推测，Tud与Aub和AGO3的结合，通过sDMA修饰，将piRNA前体招募到复合物中，其机制类似于U snRNA招募到SMN-Sm蛋白复合物中。

图5
的影响塔德卵巢Aub和AGO3上piRNA负载突变。(A类)来自wt的抗Aub（左）和抗AGO3（右）免疫沉淀物(声母)和图德用抗Tud、抗Aub、抗AGO3和SYM11（底部面板）探测突变卵巢。塔德突变没有改变Aub或AGO3的稳定性或sDMA修饰。(B类)与重量和重量中Aub（左）和AGO3（右）相关的小RNA塔德突变体被可视化³²P-标记。通过western blot分析检查大约等量Aub（左）和AGO3（右）的免疫沉淀，如(A类). 与Aub和AGO3相关的小RNA总量塔德与wt卵巢相比，突变卵巢的大小分别是wt卵巢的两倍和四倍（这个计算是用三组单独的实验数据完成的）。

图6
与Aub和AGO3相关的piRNAs的Northern blot分析。(A类)RNAs的Northern blot分析如图5B所示。DNA寡核苷酸探针鲁奥piRNA、roo#4 piRNA和*HeT-A公司*使用了piRNAs。尽管与Aub相关的小RNA总量塔德与wt卵巢（图5B）、roo#4和*HeT-A公司*-Aub复合体中衍生的piRNAs塔德与wt卵巢相比，突变卵巢的水平低得多。有趣的是，鲁奥观察到piRNA前体样信号在塔德变异卵巢。(B类)碱性处理的RNA探针（～200 nt）*I型元件*-衍生的piRNAs和DNA寡核苷酸*DM297型*-使用衍生的piRNA。(C类)用于*1立方毫米*-和*DMRT1B公司*-使用衍生的piRNAs。(D类)RNAs的Northern blot分析如图5B（右）所示。使用了一个识别piRNA的DNA寡核苷酸，即小卫星#1。在wt和塔德突变体。

图7
损失*数字电源模块5*功能降低卵巢中piRNAs对Aub的负载。(A类)与重量和重量中Aub相关的小RNA数字电源模块5突变体被可视化³²P-标签。通过western blot分析检查大约等量Aub的免疫沉淀（如图2C所示）。与Aub相关的小RNA总量*数字电源模块5*与wt卵巢相比，突变卵巢的数量大约减少了三倍（计算是用三组单独的实验数据完成的）。(B类)RNA的Northern blot分析如图所示(A类). 使用识别roo#4 piRNA的DNA寡核苷酸。信号在*数字电源模块5*变异车道。喜欢塔德，损失*数字电源模块5*功能似乎会导致异常piRNA加载到Aub上，但程度低于塔德突变体。(C类)免疫组织化学分析塔德和*数字电源模块5*使用抗Aub和抗Tud抗体的突变卵子室。在塔德突变体、Aub和Tud在哺乳细胞细微差别中的积累（箭头所示）严重受损，这两种蛋白质在细胞质中分布更均匀。在第10阶段*数据处理器5*和塔德突变体，Aub在后极聚集到相似的程度；因此，Aub在后极的积累（箭头所示）并不完全取决于sDMA修改和与Tud的关联。Tud在后极堆积*数字电源模块5*如图所示，突变体被彻底废除*vls公司*变种（Anne和Mechler，2005）。

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