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.2010年2月25日；29(8):1238-48.
doi:10.1038/onc.2009.410。 Epub 2009年11月30日。

Her2激活NF-kappaB并通过涉及IKKalpha的经典途径诱导侵袭

E C Merkhofer公司 1, P考格斯威尔, A S鲍德温
附属公司

Her2激活NF-kappaB并通过涉及IKKalpha的经典途径诱导侵袭

E C梅尔霍夫等。 癌基因. .

摘要

膜结合受体酪氨酸激酶Her2在大约30%的人类乳腺癌中过度表达，这与预后不良有关。Her2诱导的信号通路包括MAPK和PI3K/Akt，后者已被证明对Her2（+）乳腺癌细胞的生长和生存至关重要。此外，NF-κB通路已被证明在Her2过表达的下游被激活；然而，导致这种激活的机制目前尚不清楚。使用Her2（+）/ER（-）乳腺癌细胞，我们发现Her2通过经典途径激活NF-kappaB，令人惊讶的是，该途径涉及IKKalpha。敲除IKKalpha导致多个NF-kappaB调节的细胞因子和趋化因子基因的转录水平显著降低。siRNA-介导的IKKalpha基因敲除导致癌细胞侵袭减少，但对细胞增殖无影响。抑制PI3K/Akt通路对NF-kappaB活化无影响，但显著抑制细胞增殖。我们的研究表明，Her2下游NF-kappaB和PI3K通路的不同作用，导致乳腺癌细胞侵袭和增殖的变化。此外，这项工作表明IKKalpha作为Her2诱导肿瘤进展的介质的重要性。

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数字

图1
图1。拉帕替尼治疗抑制Her2过度表达细胞的NF-κB和PI3K通路
A） 磷酸化p65的蛋白质印迹436英镑在拉帕替尼治疗的多个乳腺癌细胞系中。用1μM双EGFR/Her2抑制剂拉帕替尼或DMSO载体对照治疗乳腺癌细胞株12小时。用全细胞提取物中的25μg蛋白质进行蛋白质印迹。B） 磷酸化IκBα的Western blotS32/36号在用拉帕替尼处理的SKBr3细胞中。用拉帕替尼（1μM）或二甲基亚砜对照物处理SKBr3细胞24小时，并测定磷酸化IκBα水平S32/36号通过全细胞提取物中25μg总蛋白的蛋白质印迹测定。C） 磷酸化Akt的蛋白质印迹第473页在用拉帕替尼处理的SKBr3细胞中。用双重EGFR/Her2抑制剂拉帕替尼和磷酸化Akt水平处理SKBr3细胞12小时第473页用全细胞提取物中25μg蛋白的western-blot检测。
图2
图2。Her2通过IKKα和IKKβ激活NF-κB涉及经典途径
A） 磷酸化p65的蛋白质印迹436英镑将siRNA转染到IKK催化亚单位的Her2-过表达乳腺癌细胞中。将100 nM siRNA转染SKBr3（左）、H16N2-Her2（中）和MDA-MB-453（右）细胞至IKKα和IKKβ，72小时后制备全细胞提取物并进行western blot分析。B） 对转染IKK siRNA的SKBr3、H16N2-Her2和MDA-MB-453细胞进行NF-κB荧光素酶报告检测。通过学生t检验确定了统计学上的显著差异（*<0.05**<0.001）。IKK敲低的报告活性的倍数变化显示出相对于扰乱的siRNA处理的细胞。值是至少3个实验的平均值。误差线为±1 S.E。样品根据蛋白质浓度（SKBr3）或肾素（H16N2-Her2和MDA-MB-453）进行标准化。C） 对转染IKK siRNA的SKBr3细胞进行电泳迁移率测定（EMSA）。72小时后制备核提取物。结合络合物的同一性通过与p65和p50抗体的超位移来确定。非特异性结合复合物以N.S.D）激酶测定法测量IKK在体外IκBα磷酸化。用IKK siRNA转染SKBr3细胞72小时，并从500μg全细胞提取物中免疫沉淀IKKγ。测定免疫沉淀复合物磷酸化纯化GST-IκBα的能力（KA）。测定免疫沉淀复合物（IP）和全细胞提取物（裂解物）中IKKα和IKKβ的含量。使用像素密度法计算激酶活性的折叠变化，并与干扰siRNA转染细胞进行比较。
图3
图3。Her2通过IKKα和IKKβ诱导NF-κB调节基因表达
（A） 多个基因的定量实时PCR在IKKα或IKKβ基因敲除后显示出不同的基因表达谱。对转染100 nM IKKα或IKKβsiRNA的SKBr3（黑条）和H16N2-Her2（灰条）细胞的提取物进行qRT-PCR，持续72小时。将基因表达水平归一化为Gus或GAPDH，并表示为相对于转染干扰对照siRNA的细胞的折叠变化。值是至少3个实验的平均值。误差条为±1 S.E.（B）通过siRNA敲低p65后对多个基因进行定量实时PCR。用100 nM siRNA转染SKBr3和H16N2-Her2细胞72小时，并测量基因表达水平。转录水平的折叠变化显示为相对于打乱siRNA处理的细胞。值是至少3个实验的平均值。误差条为±1 S.E.C）定量实时PCR显示拉帕替尼抑制Her2阻断NF-κB调节的基因表达。用1μM拉帕替尼处理SKBr3细胞8或16小时，并将uPA、IL-6、IL-8、TNF和CCL2的基因表达水平与DMSO处理的细胞进行比较。转录水平的折叠变化显示为相对于打乱siRNA处理的细胞。误差线为±1 S.E。
图4
图4。NEMO基因敲除通过经典途径阻断NF-κB活化
A） 她的2+用100 nM NEMO siRNA转染乳腺癌细胞，在转染72小时后收集全细胞裂解物，并使用25μg总蛋白对磷酸化p65进行western blot分析。B） 她的2+用100 nM NEMO siRNA转染细胞株，在siRNA转导72小时后制备全细胞提取物，并测量荧光素酶水平。IKK敲低的报告活性的倍数变化显示出相对于扰乱的siRNA处理的细胞。值是至少3个实验的平均值。误差线为±1 S.E。样品根据蛋白质浓度（SKBr3）或肾素（H16N2-Her2和MDA-MB-453）进行标准化。C） 用100 nM NEMO siRNA转染SKBr3细胞，72小时后分离提取物，并进行qRT-PCR。转录水平的折叠变化显示为相对于打乱siRNA处理的细胞。误差条为±1 S.E.D）Her2-过度表达的乳腺癌细胞用100 nM siRNA转染到IKKα或IKKβ，并在转染72小时后收集全细胞提取物。使用25μg总蛋白通过western blot分析测定p100和p52的水平。
图5
图5。抑制PI3K通路并不阻断NF-κB的激活
用PI3K抑制剂LY294002处理SKBr3（A）、H16N2-Her2（B）和MDA-MB-453（C）细胞2小时后，对磷酸-65丝氨酸536进行Western blot。用25μg全细胞提取物进行Western blot分析。D） 用LY294002隔夜处理SKBr3细胞的荧光素酶报告分析。与载体处理的细胞相比，PI3K抑制剂处理的报告活性发生了折叠变化。值是至少3个实验的平均值。误差线为±1 S.E。样品按蛋白质浓度标准化。
图6
图6。抑制PI3K阻止细胞增殖，敲除IKKα阻止细胞侵袭
A） 与使用CellTiter细胞活性试剂打乱siRNA处理的细胞相比，用siRNA转染IKKα或IKKβ的SKBr3细胞的细胞增殖在转染后6天内进行了测量。siRNA对IKK的敲除导致细胞增殖略有增加。误差线代表±1 S.D.（B）用PI3K抑制剂LY294002（10μM）或EGFR/Her2抑制剂拉帕替尼（1μM）处理的SKBr3细胞的细胞增殖在3天内进行了测量。这两种抑制剂在3天的疗程中均显示细胞增殖显著下降。误差条代表±1 S.D.C）SKBr3细胞，用100 nM siRNA转染IKKα或IKKβ，48小时后荧光测量细胞侵袭。通过学生的T检验测量统计显著性（*<0.01，**<0.001）。误差线代表±1 S.D。
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