Hypoxia-regulated delta-like 1 homologue enhances cancer cell stemness and tumorigenicity

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-1605

.2009年12月15日；69(24):9271-80.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-1605。

低氧调节的δ样1同源物增强癌细胞干细胞和致瘤性

尤里·金¹, 群林, 丹尼尔·泽尔特曼, 钟云

附属公司

PMID： 19934310
预防性维修识别码：项目经理2828615
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-09-1605

低氧调节的δ样1同源物增强癌细胞干细胞和致瘤性

尤里·金等。癌症研究. 2009.

.2009年12月15日；69(24):9271-80.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-1605。

作者

尤里·金¹, 群林, 丹尼尔·泽尔特曼, 钟云

附属

¹耶鲁大学医学院放射治疗学系，美国康涅狄格州纽黑文06520-8040。

PMID： 19934310
预防性维修识别码：项目经理2828615
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-09-1605

摘要

氧合减少或缺氧会抑制分化并促进干细胞维持。缺氧通常发生在实体瘤中，并促进恶性进展。缺氧肿瘤具有侵袭性，表现出干细胞样特征。然而，目前尚不清楚缺氧是否以及如何调节癌细胞分化和维持癌细胞干细胞。在这里，我们发现缺氧增加了神经肿瘤细胞中干细胞基因DLK1或delta-like 1同源物（果蝇）的表达。抑制DLK1可增强自发分化，降低克隆形成性，并减少体内肿瘤生长。DLK1的过度表达抑制分化并增强致瘤潜能。我们进一步表明，DLK1细胞质域，尤其是酪氨酸339和丝氨酸355，是维持克隆性和致瘤性所必需的。由于DLK1在许多肿瘤类型中表达升高，我们的观察结果表明，缺氧和DLK1可能是调节肿瘤干细胞样功能和致瘤性的重要干细胞途径。

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图1
缺氧诱导DLK1表达。*A、，*定量逆转录-PCR(左边)的*数据链路1*mRNA。在1%、21%O下孵育16小时后，从NB细胞制备总RNA₂或在100μmol/L去铁胺存在下。数据标准化为*高效放射治疗*mRNA在缺氧条件下无变化(柱，≥3个实验的平均值；*酒吧，*扫描电镜；*，*P（P）*< 0.05). DLK1的Western印迹(*正确的*)HIF-1α作为缺氧控制，β-肌动蛋白或PCNA作为负荷控制。*未注明。，*未确定。*B、，*DLK1的Western blot。BE（2）C细胞经逆转录病毒转导，逆转录病毒含有组成活性HIF-1α、组成活性HIF-2α或空载体(*ctrl；左边*)或表达shHIF1α、shHIF2α的慢病毒，或同时感染shHIF1(*正确的*). 细胞在1%（缺氧，*H（H）*)或21%O₂(N个).C、，使用@HIF-1α或@HIF-2α抗体的ChIP。BE（2）C细胞在1%O培养₂诱导HIF-α亚单位。使用两组不同的引物（DLK1-3D和DLK1-4P）检测*数据链路1*启动子基因*RAD51系列*引物作为阴性对照和*VEGFA（血管内皮生长因子）*引物作为阳性对照。使用终点PCR对具有预测大小的扩增子进行28个周期的验证(左边). 用qRT-PCR分析启动子结合的相对水平(*正确的*).D、，北方(左边)和Western印迹(*正确的*)对于在1%（+）或21%（−）O培养的BE（2）C细胞中的DLK1₂加入或不加入1μmol/L RA 24小时。

图2
DLK1维持未分化的NB表型。*A、，*用1μmol/L RA或10μmol/LBrdUrd诱导BE（2）C细胞分化5d。Western blot检测DLK1、Sox2、C-kit和CD-133。*B、，*BE（2）C细胞感染表达shDLK-2H、shDLK-4H或空慢病毒载体的慢病毒(控制).左侧：使用DLK1抗体对感染细胞进行染色(红色)或神经元特异性β-微管蛋白III(绿色)核染色为Hoechst 33342(蓝色). 放大倍数，×200。*正确的，*通过蛋白质印迹分析DLK1的表达，并从五到六个随机区域计数具有β-微管蛋白III阳性轴突的细胞(柱，均值；*酒吧，*扫描电镜；*，*P（P）*<0.0001与对照组）。*C、左侧，*荧光激活细胞分选（FACS）–选择表达全长DLK1的BE（2）C细胞(*DLK-FL公司*)或空逆转录病毒载体(控制)在有或没有1nmol/L RA的情况下培养3天，然后如B类放大倍数，×200。*正确的，*从五到六个随机区域中计数神经节阳性细胞(柱，均值；*酒吧，*扫描电镜；*，*P（P）*=0.0001与RA处理的对照）。*D、，*以空逆转录病毒载体为对照，对表达全长DLK1的ER细胞中CD133和Notch1进行Western blot(控制).

图3
DLK1调节肿瘤球体的形成。*A、左侧，*DLK1在球形培养基中培养的NB细胞系中的表达(球)或在标准生长介质中(控制).中部，球形培养液中BE（2）细胞球形形成过程中DLK1表达的动力学(*速度（SphM）*)1至4天。*正确的，*在含有生长介质的组织培养皿中培养2 d的BE（2）细胞中DLK1的表达(*总经理/技术委员会*)、带球形培养基的组织培养皿(*转速M/TC*)或带有球形介质的聚HEMA涂层盘子(*SphM/pHEMA公司*).B、，BE（2）C细胞感染慢病毒[shDLK-2H、shDLK-4H或载体(控制);左边]或转染siRNA寡核苷酸[siDLK-05、siDLK-07或非靶向siRNA（ctrl）；*正确的*]. 48小时后将细胞接种到聚HEMA涂层的六孔板中，并在球形培养基中培养4天。收集球体，然后用胰蛋白酶进行细胞计数(柱，均值；*酒吧，*扫描电镜；n个= 6; *,*P（P）*<0.0003与对照组）。Western blot证实DLK1基因敲除。*C、，*BE（2）C细胞感染表达shDLK-2H、shDLK-4H或载体的慢病毒(控制). 使用MTS分析每天测量细胞生长(点，均值；*酒吧，*扫描电镜；n个= 4; *,*P（P）*与对照组相比<0.05，单向方差分析）。*D、，*FACS分拣的SY5Y细胞[DLK-FL或空载体(控制)]和未感染细胞(*没有人*)在球形培养基中培养5天。计数肿瘤球中的细胞(柱，均值；*酒吧，*扫描电镜；n个= 6; *,*P（P）*<0.04（与对照组相比）。Western blot证实DLK1表达。

图4
DLK1调节克隆生长*体外试验。A、，*ER细胞经FACS分类以稳定表达DLK-FL或空载体(控制).B、，BE（2）C细胞感染慢病毒表达shDLK-2H、shDLK-4H或空载体(控制).左侧，殖民地的代表性形象。*中部，*电镀效率=每次输入菌落百分比±SEM(n个= 6; *,*P（P）*<0.0001与各自的对照）。*正确的，*蛋白质印迹。

图5
DLK1细胞质结构域是克隆生长和肿瘤球体形成所必需的。*A、，*不同哺乳动物DLK1细胞质结构域的比较。*箭头，*假定的磷酸化位点[酪氨酸（Y）-339和丝氨酸（S）-355]。*B、，*BE（2）C细胞被FACS分类为缺乏细胞质结构域的DLK1(*DLK-Δ细胞；左边*)、DLK1点突变[Y339F（苯丙氨酸）、S355A（丙氨酸）或Y339F/S355A；*正确的*]或空向量(控制). 克隆测定如图4.*所示，*P（P）*<0.0002与对照组相比。*C、，*将FACS分选的BE（2）C细胞在球形培养基中培养4 d（图3B类). *,*P（P）*与对照组相比<0.002。

图6
DLK1调节致瘤性*体内试验。A、，*BE（2）C细胞感染表达shDLK-2H、shDLK-4H或空载体的慢病毒(控制).B类和*C、，*对BE（2）C和ER细胞进行FACS分类，以获得每个结构的表达。皮下注射细胞(n个=10）裸鼠双侧前背部：2.5×10⁵用于ER电池（对照或DLK-FL）和4×10⁵BE（2）C细胞（对照，shDLK-2H，shDLK-4H，DLK-ΔCyto，Y339/S355A）。肿瘤摄取量（%）=形成肿瘤数/注射部位数×100(左边). 肿瘤体积（mm^三)=（长×宽²) × 1/2 (*A、中间*或B类–*C、权利*). 肿瘤重量=平均值±扫描电镜；*，*P（P）*<0.05与对照组(*A、右*). 有关统计的讨论，请参阅文本。

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1. Vaupel P，Mayer A.癌症缺氧：意义及其对临床结果的影响。癌症转移评论2007；26:225–39.-公共医学
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