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.2009年11月10日；2（96）：ra72。
doi:10.1126/scisional.2000464。

通过蛋白质S-硫水合发出H2S信号

阿西夫·穆斯塔法 1, 莫阿塔兹·加达拉, 尼尔坎塔·森, 金赛云（Seyun Kim）, Weitong Mu公司, 萨迪亚·K·加齐, 罗珊·巴罗, 广东洋, 王瑞（Rui Wang）, 所罗门·H·斯奈德
附属公司

通过蛋白质S-硫水合发出H2S信号

阿西夫·穆斯塔法等。 科学信号. .

摘要

硫化氢（H2S）是胱硫醚γ-裂合酶产生的信使分子，是一种生理性血管舒张剂。H2S信号难以捉摸的机制。我们现在表明，H2S通过S-硫水合作用在生理上修饰大量蛋白质中的半胱氨酸。大约10%到25%的肝脏蛋白质，包括肌动蛋白、微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），在生理条件下是含硫的。硫水合增加GAPDH活性并增强肌动蛋白聚合。因此，硫酸化似乎是蛋白质的一种翻译后生理修饰。

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数字

图1
图1
H（H）2S通过半胱氨酸残基的S-硫水合作用共价修饰蛋白质。(A类)用100μM NaHS在37°C下处理30分钟的肝裂解物，并用抗生物素抗体（抗生物素Ab）进行改良的生物素开关试验，以检测S-硫水合反应，结果显示有许多含硫蛋白质。(B类)（a）中的一组含硫蛋白质的LC-MS/MS鉴定出39种含硫蛋白质，包括GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白。(C类)DTT处理（1mM）10分钟可逆转GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的硫水合作用，用每种蛋白质的特异性抗体检测，这意味着共价巯基修饰。(D类)在用编码CSE的质粒转染的HEK293细胞中，暴露于5 mM L-半胱氨酸1小时会导致GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白硫酸化，这是通过使用三种蛋白中每一种蛋白的特异性抗体的改良生物素开关试验进行评估的。催化失活的CSE不能将蛋白质硫化。
图2
图2
硫水合是一种缺乏的翻译后生理修饰CSE公司−/−动物。(A类)H的测量2H的S生产2S选择电极表明CSE公司−/−肝脏不能产生H2所有结果均以平均值±SEM表示***P（P）< 0.001. (B类)改良的肝脏生物素开关试验显示野生型中存在内源性GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的生理硫酸化，但没有CSE公司−/−动物。(C类)肝脏中基础蛋白亚硫酸化的定量密度分析。数据是五到七个独立实验的平均值±SEM，代表性数据如（B）和（D）所示。(D类)在37°C条件下，将CSE底物L-半胱氨酸的外源剂量增加培养30分钟，对肝裂解物进行改良的生物素开关试验，结果表明野生型中的硫水合作用呈剂量依赖性增加，而不是CSE公司−/−动物。未经处理的通道代表内源性肝脏硫酸化，显示GAPDH的信号比β-微管蛋白或肌动蛋白的信号大得多，与（C）中描述的平均值一致。(E类)（D）定量GAPDH硫水合随L-半胱氨酸外源剂量增加而变化的密度分析。数据是五到七个独立实验的平均值±SEM。
图3
图3
GAPDH的硫酸化发生在Cys150. (A类)小鼠肝脏内源性全长GAPDH蛋白免疫沉淀的HPLC和LC-MS/MS显示Cys的硫酸化150附加质量约为32.058道尔顿。米/z（z）是质量荷电比；Cys周围的氨基酸序列150显示在底部。(B类)用100μM NaHS在37°C下处理30分钟的纯化全长人GAPDH蛋白的LC-MS/MS显示出与Cys一致的质量偏移150（人体为152）水合硫。用100μM NaHS和1 mM DTT或500μM H处理后，无法检测到硫水合或硫化2O（运行）2分别是。(C类)在37°C下用100μM NaHS处理30分钟的HEK293细胞的改良生物素开关试验。C150S突变体不含硫。(D类)放射性标记GAPDH的硫酸化[35S] 37°C下的半胱氨酸和CSE。通过添加1 mM DTT或将CSE蛋白煮沸5分钟来逆转GAPDH放射性标记。数据通过切伦科夫闪烁计数进行量化。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01. (E类)放射性标记野生型和C150S GAPDH[35S] 半胱氨酸和CSE。C150S突变体未标记。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01.
图4
图4
硫水合从生理上提高了GAPDH的催化活性。(A类)在37°C下，随着NaHS浓度的增加，体外测定GAPDH活性。NaHS剂量依赖性地激活GAPDH。(B类)DTT（1 mM）通过10μM NaHS逆转体外GAPDH激活。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01. (C类)用15μM NaHS体外测定野生型与C150S突变型GAPDH活性。野生型（wt）而不是C150S GAPDH被NaHS激活。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01. (D类)在添加或不添加10μM NaHS的情况下，随着底物G3P浓度的增加，GAPDH活性增加。NaHS总体增加V（V）最大值不影响K米（约0.8毫微米）。(E类)HEK293细胞中的GAPDH活性，无任何转染或编码野生型CSE或无催化活性CSE的质粒转染，并在37°C的培养基中与浓度增加的L-半胱氨酸孵育1小时。GAPDH在野生型CSE存在下以剂量依赖的方式被激活。(F类)来自野生型与野生型的体内GAPDH活性CSE公司−/−肝脏。生命来自CSE公司−/−小鼠GAPDH活性降低(n个=6只动物）。所有结果均为平均值±SEM*P（P）< 0.05.
图5
图5
硫酸化促进体外和HEK293细胞中肌动蛋白聚合。(A类)肌动蛋白在体外与200μM NaHS在37°C下硫酸化30分钟，DTT（200μM，10分钟）逆转了这一效果。(B类)在HEK293细胞中，NaHS（37°C下100μM持续30分钟）可使肌动蛋白硫酸化。(C类)对用100μM NaHS在37°C下处理1小时的HEK293细胞进行免疫细胞化学分析，发现肌动蛋白细胞骨架发生重排（箭头所示为含有肌动蛋白丝的细突起在单个NaHS处理细胞中的延伸）。肌动蛋白被染成红色。标尺，20μm。(D类)NaHS（200μM）在体外增强肌动蛋白聚合，DTT（200μM）可逆转此效应。(E类)NaHS（200μM）对肌动蛋白解聚没有影响。
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