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.2009年12月；175(6):2351-61.
doi:10.2353/ajpath.2009.080954。 Epub 2009年11月5日。

肺纤维化的基因表达谱确定Twist1是生长因子信号传导的抗凋亡分子“整流器”

罗伯特·斯布里奇斯 1, 卫生局助理局长卡斯, 卡特里娜·洛伊, Carlota Glackin公司, 阿兰·博尔祖克, 史蒂芬·格林伯格
附属公司

肺纤维化的基因表达谱确定Twist1是生长因子信号传导的抗凋亡分子“整流器”

罗伯特·布里奇斯等人。 美国病理学杂志. 2009年12月.

摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性的、典型的致命性肺部疾病。为了深入了解IPF发病机制，我们对IPF肺部进行了基因表达谱分析。Twist1是一种基本的螺旋-环-螺旋蛋白，在最稳定和高度上调的基因中被发现，并在IPF肺的II型上皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的细胞核中表达。我们进一步研究了成纤维细胞中Twist1的功能，因为它们是本病的主要效应细胞，尽管周围存在促凋亡环境，但它们仍然存在。Twist1由原代大鼠肺成纤维细胞中的纤维化前生长因子（GFs）碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和表皮生长因子诱导产生。Twist1表达的抑制导致凋亡增加导致RLF积累减少，而Twist-1过度表达保护RLF免受多种凋亡刺激。血小板衍生生长因子与其他GF联合使用可增加增殖。当Twist1耗尽时，GFs继续充当有丝分裂原，但导致细胞死亡显著增加。在基础或生长因子刺激的条件下，凋亡增加部分由促凋亡Bcl-2家族成员Bim和PUMA的上调介导。这些发现表明，Twist1通过塑造成纤维细胞对生长因子刺激的反应性来促进成纤维细胞的存活和积累。我们认为Twist1是促进纤维化肺疾病中成纤维细胞致病性积聚的因素之一。

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数字

图1
图1
IPF患者肺部Twist1的表达。答：来自微阵列数据的Twist1 mRNA表达热图。B：IPF患者肺部Twist mRNA归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA的定量RT-PCR(n个=7）和控制(n个= 5). 数据表示平均值±SEM；∗P（P）< 0.05.抄送：使用抗Twist1亲和纯化IgG对对照肺和IPF肺进行免疫组化。Twist1定位于成纤维细胞的细胞核(箭头)和II型上皮细胞(箭头)成纤维细胞病灶。对照肺和同型对照染色显示几乎没有可检测的染色。放大倍数，×400。
图2
图2
原发性RLF中Twist1的表达对纤维化GFs的反应。答：RLF保存在0.5%的FBS中，与10 ng/ml的指示GFs在37°C下孵育16小时。分离RNA并对Twist1 mRNA进行qRT-PCR，将其归一化为PPIA mRNA。数据表示为基线的倍数增加，代表平均值±SEM，n个= 6–8.∗P（P）< 0.05;∗∗P（P）< 0.01.B：粘附的RLF与10 ng/ml的指示GFs孵育16小时，并使用亲和纯化的兔抗Twist1和DAPI IgG进行间接免疫荧光处理。棒材=10μm。抄送：Twist1核染色荧光强度的定量如材料和方法数据表示来自至少三个独立实验的>80个细胞的平均±SEM。∗P（P）< 0.005;∗∗P（P）< 0.001.
图3
图3
减少Twist1 mRNA和蛋白质对Twist1-siRNA的反应。答：如中所述，在37°C下，在存在Twist1或对照siRNA寡核苷酸的情况下培养维持在0.5%FBS中的粘附RLF 3天材料和方法并使用亲和纯化的兔抗Twist1 IgG进行间接免疫荧光处理(左边 面板)和DAPI(正确的 面板). 缩微照片代表至少10个单独的实验。棒材=10μm。B：粘附的RLF，在37°C下，在Twist1（白色条）或对照（黑色条）siRNA寡核苷酸中培养3天，在有或无指示生长因子的情况下培养最后24小时。分离RNA并对Twist1 mRNA进行定量RT-PCR，将其归一化为PPIA mRNA。数据表示为基线水平的倍增，代表平均值±SEM，n个= 6;∗P（P）< 0.05.抄送：Twist-1核染色荧光强度的定量如材料和方法。Twist1表达在未转染细胞和用扰乱对照寡聚体转染的细胞之间没有定性差异（数据未显示）。数据表示来自至少四个独立实验的至少100个细胞的平均值±SEM。∗P（P）< 0.001.
图4
图4
Twist1 siRNA对RLF中细胞数量、增殖和caspase-3活性的影响。A类和B：转染有所示siRNA寡核苷酸的RLF按照所示进行培养，并按照所述测定相对细胞数材料和方法数据表示平均值±SEM，n个= 6;∗P（P）< 0.05;∗∗P（P）< 0.005.抄送：RLF培养方式如下A类和B类，并在使用针对BrdU的mAb进行免疫荧光之前的最后18小时内加入10μmol/L BrdU。数据表示平均值±SEM，n个= 6.医生：RLF培养方式如下A类和B类，caspase-3活性如材料和方法数据表示平均值±SEM，n个=4（血清饥饿）或11（0.5%血清）；∗P（P）< 0.05;∗∗P（P）< 0.005.
图5
图5
Twist1过度表达对受纤维化肺中促凋亡因子攻击的RLF生存的影响。答：转染FLAG-tagged Twist1的RLFs在0.5%FBS存在下暴露于氧化剂（12μmol/L 4-HNE）和内质网应激（2μmol/Lthapsigargin；（Thaps））过夜。细胞数量按材料和方法(n个=分析的4595个细胞）；∗P（P）< 0.01.B：用Twist siRNA转染后2天，在0.5%的FBS中用凋亡诱导刺激物（5μmol/L 4-HNE、0.8μmol/Lthapsigargin、50 ng/ml TNF-α或10 ng/ml Fas配体（FasL）刺激RLF。通过caspase-3活性测量凋亡，并将其归一化为细胞数。数据表示平均值±SEM，n个= 4.∗P（P）< 0.05.
图6
图6
Twist1 siRNA对Bcl-2家族成员表达的影响。答：RLF与Twist1（白色条）或对照（黑色条）siRNA孵育，提取并处理RNA，以对指定的BH3-only家族成员进行qRT-PCR，并将其归一化为PPIA mRNA。数据表示平均值±SEM，n个= 3–5.∗P（P）< 0.001.B：RLF与siRNA寡核苷酸孵育，如A类制备洗涤剂提取物，并使用所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹。数据是三个独立实验的代表。
图7
图7
基于shRNA的Bim和PUMA表达减少对Twist1 siRNA诱导的细胞死亡的影响。答：RLF与指示的shRNA编码质粒和编码EGFP的质粒共转染，第二天在存在Twist siRNA寡核苷酸的情况下进行替换，并在37°C的0.5%血清中再培养72小时。细胞固定，DAPI染色，荧光显微镜观察。注意在表达对照shRNA的细胞中，典型的晚期凋亡的小浓缩细胞核(左边 面板)或EGFP阴性细胞不表达Bim shRNA(正确的 面板). 表达EGFP-和Bim-shRNA-编码质粒的细胞核形态保存明显(箭头).B：对表达EGFP的细胞进行凋亡细胞核存在或不存在的评分。条形图表示计数的单元格总数，n个=8个独立实验中的800–2000个细胞。∗P（P）< 0.01;∗∗P（P）< 0.001.
图8
图8
在存在促纤维化GFs的情况下，Twist1敲低对细胞存活的影响。A类,B：在用对照（白色条）或Twist1（黑色条）siRNA转染两天后，RLF与10 ng/ml的指示GFs在0.5%FBS中孵育过夜，并按照材料和方法。在第3天将生长因子刺激的细胞数量与未刺激的细胞进行比较。注意，在转染Twist1（白条）而非对照（黑条）siRNA的细胞中，PDGF未改变细胞数量，而bFGF、EGF和PDGF使细胞数量减少。数据表示平均值±SEM，n个= 4.∗P（P）< 0.05.C,医生：RLF培养方式如下A类和BrdU公司(C)和caspase-3活性(D类)按照中所述进行测量材料和方法数据表示平均值±SEM，n个= 4–7.∗P（P）< 0.02;∗∗P（P）< 0.002;∗∗∗P（P）< 0.0001.
图9
图9
基于shRNA的Bim和PUMA表达减少对Twist1 siRNA和GFs诱导的细胞死亡的影响。A类和B：RLFs与Twist1（白色条）或对照（黑色条）siRNA孵育，并加入10ng/ml PDGF或10ng/ml每种bFGF、EGF和PDGF的组合，持续最后24小时。提取并处理RNA，用于Bim的qRT-PCR(A类)或PUMA(B类)归一化为PPIA表达。数据表示平均值±SEM，n个= 4.∗P（P）< 0.001.抄送：RLF裂解物的免疫印迹A类和B类.医生：将RLF与编码EGFP的质粒和指示的shRNA-编码质粒共转染，并在0.5%血清中存在Twist siRNA寡核苷酸的情况下重新转染3天。在过去的24小时内，在bFGF、EGF和PDGF各10 ng/ml的浓度下培养细胞。用DAPI对固定细胞进行染色，并对EGFP表达细胞是否存在凋亡细胞核进行评分。白条，活细胞；灰色或黑色条，不活动单元格。数据表示平均值±SEM，n个=三到五个独立实验中的200–600个细胞。∗P（P）< 0.01;∗∗P（P）< 0.001;∗∗∗P（P）< 0.0001.
图10
图10
Twist1过度表达对Bim表达的影响。转染FLAG-tagged Twist1（白色条）或对照质粒（黑色条）的RLF在0.5%FBS存在下暴露于氧化剂（12μmol/L 4-HNE）或内质网应激（2μmol/Lthapsigargin；（Thaps））过夜。细胞数量按材料和方法(n个=250个单元/分析的条件）；∗P（P）< 0.0001.
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