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.2010年1月1日；21(1):106-16.
doi:10.1091/mbc.e09-07-0639。 Epub 2009年10月28日。

一种新型小鼠HSF3在热休克期间具有激活非经典热休克基因的潜力

藤本光明 1, 直纪林下, 加藤隆, 大岛口吉, 东芝新川, 拉马钱德兰·普拉卡萨姆, 柯坦, Sachiye Inouye公司, Takii龙介, 中井明拉
附属机构

一种新型小鼠HSF3在热休克期间具有激活非经典热休克基因的潜力

藤本光明等人。 分子生物学细胞. .

摘要

热休克反应以一组经典热休克基因的表达为特征，并受哺乳动物热休克转录因子1（HSF1）的调控。然而，对基因表达的综合分析揭示了热休克细胞中存在大量的诱导基因。虽然HSF2和HSF4调节一些基因的表达，但人们认为HSF1是这些基因热诱导表达所必需的。在这里，我们发现了一种新的小鼠HSF3（mHSF3）在热休克期间易位到细胞核。然而，mHSF3并没有激活Hsp70等经典热休克基因。值得注意的是，mHSF3的过度表达恢复了HSF1-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中非经典热休克基因的表达，如PDZK3和PROM2。尽管mHSF3表达下调对野生型MEF细胞中的基因表达或细胞存活没有影响，但在热休克期间，它消除了PDZK3 mRNA的适度表达，并降低了HSF1-null MEF细胞的细胞存活率。我们认为mHSF3代表一种独特的HSF，它可能只激活非经典的热休克基因，以保护细胞免受有害应激。

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图1。
图1。
含有高速缓冲存储器基因。每个片段的位置如下：人类Chr.8 q24.3和小鼠Chr.15 D3高铁1号线基因；人类Chr.6 q22.31、小鼠Chr.10 B4和鸡63.95–63.98 Mb高铁2号楼基因；人类Chr。X q12，鼠标Chr。X B4，鸡肉0.252–0.265 Mb高速三层基因；人类Chr.16q22.1、小鼠Chr.8D3和鸡2.44–2.45Mb高铁四号线基因。与鸡HSF1 cDNA相对应的基因组序列尚未确定。箭头表示每个基因的5′至3′方向。人类X染色体上的灰色方框可能是高速三层假基因。
图2。
图2。
的结构mHSF3型基因及其产物的DNA结合活性。（A） 外显子和内含子用方框和线条表示。外显子1和外显子1a分别编码mHSF3a和mHSF2b的翻译起始位点。编码功能域的外显子显示在顶部。DBD，DNA-结合域；HR-A/B，疏水性氨基酸A和B的七肽重复序列；DHR，七肽重复序列下游。底部显示了用于通过RT-PCR扩增cDNA片段I–V的引物的位置和方向。（B） 使用来自6周龄ICR小鼠不同组织的总RNA进行RT-PCR。质粒pcDNA3.1-mHSF3a或b用作对照PCR（mHSF3）的模板。对cDNA片段I–V进行测序。片段II和上部片段V包含外显子11，而片段I和下部片段V不包含。（C） mHSF3a和mHSF2b的结构比较。显示了氨基酸的数量。mHSF3b包含mHSF3的一部分DBD结构域（氨基酸34–114）。（D） mHSF3a专门与HSE绑定。GST和mHSF3a、mHSF2b、hHSF1和hHSF4融合到GST后在大肠杆菌中表达。细菌细胞裂解物与32P-标记的理想HSE寡核苷酸，并负载在4%的天然凝胶上（左）。HSF、HSF：HSE综合体；自由，自由探针。竞争分析是使用含有三个完整nGAAn单元的冷HSE86寡核苷酸及其突变体作为竞争对手进行的。（E） GST-mHSF3a与人启动子结合的DNase I足迹分析热休克蛋白70基因。越来越多的含有GST-mHSF3a的裂解物（0、0.5、1、2和4μl细胞裂解物）被检测。连续，零微升裂解液；A+G、A和G梯子。HSE包含五个倒置的nGAAn装置，位于−91至−115。
图3。
图3。
HSF超级家族成员。（A） 小鼠和鸡HSF家族成员和HSF相关基因产物的图示。使用计算机程序GENETYX-MAC建立小鼠HSF1和每个HSF之间的百分比一致性。每个HSF的氨基酸数量显示在氨基末端。DBD，DNA-结合域；HR，疏水七肽重复序列；DHR，HR-C.mHSF1和mHSF2下游（Sarge等。, 1993); mHSF4（塔纳比等。, 1999); cHSF1、cHSF2和cHSF3（Nakai和Morimoto，1993）；mHsfy2（最初被鉴定为mHSFY，但其基因不位于小鼠Y染色体上；Shinka等。, 2004; 泰萨里等。, 2004); hHSFX1/LW-1（Swiss-Prot登录号Q9UBD0）。本研究确定了mHSF3（mHSF3a）和cHSF4（cHSF4b）。虚线框表示一个类HR-C结构域，其中疏水性氨基酸没有很好地保存（补充图2）。HSF家族成员DBD结构域的一部分与mHsfy2和hHSFX1中的一个区域保守。（B） CLUSTAL W（汤普森）中生成的系统发育树等。（1994年）。所有系统发育分析均排除了间隙。数字表示引导值（执行了1000次引导复制）。未生根的树是用TREEVIEW程序绘制的（Page，1996）。Bar，每个站点0.05个替换。树结构中使用的氨基酸序列是hHSFY1(高速财年1基因及其同源第二季度基因位于人类Y染色体上；Swiss-Prot登录号Q96LI6）、mHsfy2（SP登录号Q80Y37）和hHSFX1（SP登录编号Q9UBD0）。之前显示了其他HSF家族成员的氨基酸序列（Inouye等。, 2003).
图4。
图4。
mHSF3a在热休克反应中转位到细胞核。（A） mHSF3a、mHSF3b和与GFP融合的突变体的示意图。GFP-m3a-NLSmu中的核定位信号发生突变。（B） 用表达载体转染COS7细胞。制备细胞提取物，并使用GFP抗体进行免疫印迹。（C） 转染表达载体48小时的COS7细胞在42℃下热休克1小时，然后用4%多聚甲醛固定。在Axiover显微镜下检查荧光。
图5。
图5。
mHSF3a无法激活热休克蛋白70基因。（A） 小鼠和鸡HSF3之间嵌合体以及小鼠HSF3a和人类HSF1之间嵌合体的示意图（左）。显示了氨基酸在每个结构域末端的位置。h383/m嵌合体包含融合到小鼠HSF3a（氨基酸380-492）的人类HSF1（氨基酸1-384）。用每个表达载体或无载体感染HSF1-完整MEF细胞，在42℃下热休克1 h，然后在37℃下恢复3 h。制备细胞提取物，并使用Hsp70、mHSF3、cHSF3，HSF1和β-肌动蛋白抗体进行Western印迹（右）。（B） 感染Ad-GFP、Ad-mHSF3a和Ad-hHSF1的HSF1-null MEF细胞在42℃下热休克1 h，然后在37℃下恢复0或3 h。制备细胞提取物，并使用Hsps、HSF1、GFP和β-actin抗体进行Western blotting。
图6。
图6。
mHSF3a不招募BRG1。（A） 用表达GFP、mHSF3a或hHSF1的腺病毒感染永生HSF1-null MEF细胞，然后在42℃下热休克1 h。使用mHSF3（α-mHSF3-1）、hHSF1（α-cHSF1c）和免疫前血清（P.I.）抗体进行ChIP。使用Hsp70启动子（−272至+47）及其下游区域（+353至+613）的引物扩增沉淀DNA。（B） 感染每个腺病毒的HSF1-null MEF细胞在42°C下热休克1h，并使用Hsp70启动子及其下游区域的引物进行染色质沉淀和DNA扩增。（C） 用表达mHSF3a、hHSF1或嵌合c389/m和h383/m的腺病毒感染HSF1-完整MEF细胞。在NP-40裂解缓冲液中制备细胞提取物，并使用BRG1（大鼠IgG）、mHSF3（α-mHSF3-1）和hHSF1（α-cHSF1x）抗体进行免疫沉淀。沉淀的复合物通过使用相同的抗体进行蛋白质印迹。（D） 感染每个腺病毒的HSF1-完整MEF细胞在42°C下热休克1 h。使用BRG1和免疫前抗体进行ChIP，并使用Hsp70启动子及其基因下游区域的引物进行DNA扩增。（E） BRG1表达减少导致hHSF1和c389/m介导的Hsp70诱导减少。HSF1-完整MEF细胞与表达mHSF3a、hHSF1、c389/m（低水平和高水平）或h383/m和shBRG1（shBRG1-R3）或干扰RNA（SCR）的腺病毒共同感染。然后在42℃下对细胞进行（热+）或不进行（热-）热休克处理1 h，在37℃下恢复3 h。通过Western blotting（顶部）检测Hsp70的表达水平，并量化（底部）。三个独立实验显示了平均值和标准偏差。
图7。
图7。
mHSF3a激活非经典热休克基因。（A） 野生型（+/+）和HSF1-null（−/−）MEF细胞在42°C下受到热休克，并在37°C下恢复指定的时间段，并且进行RT-PCR以检查PDZK3、PROM2和S16核糖体蛋白的mRNA水平。（B） 感染表达GFP、mHSF3a或cHSF1的腺病毒的HSF1-完整MEF细胞在42°C下进行热休克，然后在37°C下恢复指定时间，并进行RT-PCR。（C） 未感染野生型MEF细胞或感染表达shHSF3-R1、shHSF3-R2或干扰RNA的腺病毒。使用mHSF3或β-actin抗体进行Western blot分析。箭头和星号分别表示mHSF3和非特定带。（D） HSF1-null MEF细胞与C细胞一样受到感染。细胞在42℃下热休克1 h（+），然后静置恢复0或1 h。进行RT-PCR（顶部），并量化PDZK3 mRNA水平（底部）。平均值和标准差来自三个独立的实验；显著性（p<0.05）。（E） 腺病毒感染的HSF1-完整MEF细胞在42℃下热休克1 h。使用免疫前血清（P.I.）和mHSF3和cHSF1抗体进行ChIP分析，而使用PDZK3启动子引物进行DNA扩增（−529至+24）。（F） 将HSF1-完整MEF细胞与表达每个HSF和shBRG1或干扰RNA的腺病毒共感染。使用每个特定抗体进行免疫印迹。（G） 然后在C中制备的细胞在42°C下进行（热+）或不进行（热-）热休克处理1 h，在37°C下恢复3 h。通过RT-PCR检测PDZK3、Hsp70和S16核糖体蛋白的mRNA水平（顶部），并量化PDZK3mRNA水平（底部）。三个独立实验显示了平均值和标准偏差。
图8。
图8。
mHSF3a保护细胞免受高温应激。（A） 用表达GFP、mHSF3a或cHSF1的腺病毒感染野生型和HSF1-null MEF细胞的原代培养物。使用每种特定抗体进行蛋白质印迹（左）。每个腺病毒感染细胞24小时，然后在42°C下孵育0、2、4和6小时，并对附着的细胞进行计数（右）。三个独立实验显示了平均值和标准偏差。（B） 用表达GFP、mHSF3a、mHSF 3aR65A、mHSF-3aR65 G或cHSF3的腺病毒感染野生型和HSF1非完整细胞24小时，然后在42°C下培养4小时。对附着细胞进行计数（左），并进行MTT分析（右）。平均值和标准偏差由三个独立实验显示；显著性（p<0.05）。（C） 野生型和HSF1-null（−/−）细胞在没有（−）或表达shHSF3-R1、shHSF3-R2或搅乱RNA的腺病毒的情况下共同感染72小时，然后在42°C下孵育6小时。对附着的细胞进行计数（顶部），并进行MTT分析（底部），如B所示。五个独立实验显示了平均值和标准偏差；显著性（p<0.05）。
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