MeCP2 controls an epigenetic pathway that promotes myofibroblast transdifferentiation and fibrosis

doi:10.1053/j.gastro.2009.10.002

.2010年2月；138（2）：705-14，714.e1-4。

doi:10.1053/j.gastro.2009.10.002。 Epub 2009年10月17日。

MeCP2控制促进肌成纤维细胞转分化和纤维化的表观遗传途径

杰勒娜·曼¹, 大卫·C·K·楚, 艾丹·麦克斯韦, 菲奥娜·奥克利, 念玲朱, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 德里克·阿曼

附属公司

PMID： 19843474
预防性维修识别码：项目经理2819585
内政部： 10.1053/j.gastro.2009.10.002

MeCP2控制促进肌成纤维细胞转分化和纤维化的表观遗传途径

杰勒娜·曼等。胃肠病学. 2010年2月.

.2010年2月；138（2）：705-14，714.e1-4。

doi:10.1053/j.gastro.2009.10.002。 Epub 2009年10月17日。

作者

杰勒娜·曼¹, 大卫·C·K·楚, 艾丹·麦克斯韦, 菲奥娜·奥克利, 念玲朱, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 德里克·阿曼

附属

¹英国泰恩河畔纽卡斯尔大学医学院细胞医学研究所。jelena.mann@ncl.ac.uk

PMID： 19843474
预防性维修识别码：项目经理2819585
内政部： 10.1053/j.gastro.2009.10.002

摘要

背景和目标：肌成纤维细胞转分化产生肝肌成纤维蛋白，促进肝纤维化。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARgamma）是该过程的负调控因子。我们研究了PPARgamma和肌成纤维细胞转分化的表观遗传调控。

方法：染色质免疫沉淀（ChIP）分析评估了甲基-CpG结合蛋白2（MeCP2）与PPARgamma的结合以及沉默该基因的染色质修饰。在四氯化碳肝纤维化模型中使用MeCP2（-/y）小鼠和表观遗传调节蛋白EZH2抑制剂（DZNep）。通过组织学分析评估小鼠肝组织；通过定量聚合酶链反应（qPCR）测定纤维化标志物。逆转录聚合酶链反应检测到microRNA miR132及其靶基因MeCP2加长转录物的表达变化。miR132转染肌成纤维细胞；通过qPCR或免疫印迹分析PPARgamma和MeCP2的表达。

结果：肝星状细胞的肌成纤维细胞转分化由MeCP2、EZH2和miR132在中继途径中的组合控制。该途径通过下调miR132激活，释放MeCP2上的翻译阻滞。MeCP2被招募到PPARgamma的5'端，在那里它通过H3K9促进甲基化并招募转录阻遏物HP1alpha。MeCP2还刺激EZH2的表达和H3K27的甲基化，在PPARgamma的3’外显子中形成抑制性染色质结构。MeCP2或EZH2的遗传和药理学破坏降低了肌成纤维细胞的成纤维特性并减弱了纤维生成。

结论：肝纤维化受包括MeCP2、EZH2和miR132在内的表观遗传中继途径调控。干扰这一途径的试剂可能被开发用于减少慢性肝病中的纤维化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者报告没有利益冲突

数字

**图1。MeCP2调节肌成纤维细胞PPARγ的减少**
(一)通过qRT-PCR定量大鼠qHSC和第10天转分化肌成纤维细胞的PPARγmRNA水平。(b条)将从大鼠HSC和肌成纤维细胞获得的100μg交联染色质与10μg抗RNAPolII磷酸化Ser2孵育；进行ChIP分析，扩增大鼠PPARγ外显子A2。(**c（c）**)使用10μg抗MeCP2抗体进行ChIP分析，如（1b）所示；qPCR扩增PPARγ外显子和启动子。(d日) 5×10⁶用2μg总siRNA电穿孔大鼠肌纤维母细胞，设计靶向大鼠MeCP2并通过western blot证实敲除。(**e（电子）**)从对照细胞或大鼠MeCP2 siRNA转染细胞中分离出总RNA，并用大鼠PPARγ特异性引物作为qRT-PCR反应的模板。p=0.0019(**（f）**)静态HSC从Wt C57Bl6或*机械2^-/年*小鼠与转分化*在体外*持续14天。从细胞群体和PPARγmRNA中制备总RNA，通过qRT-PCR p=0.031进行量化。

**图2。MeCP2敲除减弱纤维生成**
(一)从冷冻CCl中分离的200μg全细胞蛋白提取物₄受伤Wt或*机械2^-/年*用SDS-PAGE分离肝脏，将蛋白质转移到膜上，并对MeCP2进行免疫印迹。(b条)从冷冻CCl中分离出RNA₄受伤Wt或*机械2^-/年*肝脏，并使用小鼠PPARγ（p=0.0025）、I型胶原（p=0.036）、TIMP-1（p=0.03）和α-SMA（p=0.06）特异性引物进行qRT-PCR反应。(**c（c）**)CCl切片上的天狼星红免疫染色₄受伤Wt或*机械2^-/年*肝脏（×5倍放大）。(d日)来自5Wt和5Wt的天狼星红免疫染色切片*机械2^-/年*CCl公司₄根据Metavir量表（p=0.0015）和(**e（电子）**)通过形态计量学定量（p=0.0029）。5只动物的平均结果。(**（f）**)qHSC是从Wt或*机械2^-/年*肝脏与转分化*在体外*持续14天。从两个细胞群体中制备总RNA，并使用小鼠胶原蛋白1特异性引物进行qRT-PCR（p=0.032）。

**图3。MeCP2在HSC中的表达**
(一)用SDS-PAGE分离培养第1、2、3和7天从新鲜分离的HSC中提取的30μg全细胞提取物，并对MeCP2和β肌动蛋白进行免疫印迹。(b条)从qHSC（培养第0天）和肌成纤维细胞（培养第7天）分离的RNA用于MeCP2和β肌动蛋白或肌动蛋白的半定量RT-PCR分析(**c（c）**)或用短/长MeCP2转录物特异性引物进行询问。

**图4。miR132调节MeCP2的表达**
(一)使用miRNeasy迷你试剂盒从大鼠qHSC和肌成纤维细胞中分离出微RNA，并使用miScript逆转录试剂盒进行逆转录。miR132通过miScript引物分析218300检测。(b条)从BDL（或假对照）和CCl后小鼠肝脏分离的HSC中纯化微RNA₄如上所述检测到（或橄榄控制）损伤和miR132。(**c（c）**到**e（电子）**) 5×10⁶将肌成纤维细胞与2μg miR132模拟或对照siRNA混合并电穿孔。48小时后采集细胞进行RNA和全细胞蛋白提取。(**c（c）**)通过miScript引物分析218300定量mIR132(d日)用SDS-PAGE分离全细胞蛋白提取物，并对MeCP2和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(**e（电子）**)进一步将（b）中获得的cDNA用作PPARγ的qRT-PCR分析模板。(**（f）**)天然染色质由*在体外*转分化Wt或*机械2^-/年*肌成纤维细胞。100μg天然染色质与10μg抗二甲基H3K27、H3K9或H3K4孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA作为模板，使用小鼠PPARγ启动子特异性引物进行qPCR反应。

**图5。MeCP2调节HP1α募集、EZH2和H3K27甲基化的表达**
(一)将100μg来自大鼠肌成纤维细胞的交联染色质与10μg抗HP1α孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA作为模板，使用大鼠基因中PPARγ启动子/外显子特异性引物进行qPCR反应。(b条)将从大鼠HSC或肌成纤维细胞制备的100μg天然染色质与10μg抗二甲基H3K27（顶部）或抗三甲基H3K4（底部）孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA作为模板，使用大鼠PPARγ启动子/外显子特异性引物进行qPCR反应(**c（c）**)用SDS-PAGE分离培养第1、2、3和7天从新鲜分离的HSC或肌成纤维细胞中提取的30μg全细胞提取物，并对EZH2和β肌动蛋白进行免疫印迹。（d）使用从BDL（或假手术）和CCl分离的HSC提取的RNA对EZH2 mRNA进行qRT-PCR分析₄（或橄榄油）损伤大鼠肝脏（n=5）（p=0.0184）。(**e（电子）**)从转染2μg对照或MeCP2 siRNA的肌成纤维细胞中分离的RNA（来自图1e）用于EZH2的qRT-PCR分析（p=0.0152）(**（f）**)来自Wt或*机械2^-/年*肌成纤维细胞（来自图1f）用于EZH2表达的qRT-PCR分析（p=0.0478）。

**图6。EZH2调节PPARγ、肌成纤维细胞转分化和纤维生成**
(一)和(b条) 5×10⁶用2μg对照或EZH2 siRNA电穿孔大鼠肌成纤维细胞。分离总RNA并用于EZH2-的qRT-PCR检测(一)或PPARγ（p=0.0012）(b条). (**c（c）**)肌成纤维细胞用1μM 3-二氮杂卓霉素A或载体处理72h；制备总RNA并用于PPARγ的qRT-PCR检测。(d日)将新鲜分离的大鼠HSC在标准培养基（底部显微照片）或含有1μM 3-二氮杂卓霉素A（顶部显微照片）的培养基中培养12小时，清洗培养物并用标准培养基替换，细胞再培养10天。(**e（电子）**)5c中获得的RNA用于I型胶原和TIMP-1的qRT-PCR检测。(**（f）**)CCl分离RNA中1型胶原和TIMP-1转录物的qRT-PCR分析₄对照组或小鼠的损伤肝脏用3-去甲肾上腺素A预处理1小时（n=4）。

**图7。mIR132、MeCP2和EZH2在调节表观遗传中继途径中运作，最终导致PPARγ转录抑制**
在qHSC中，miR132对MeCP2转录物施加翻译阻断。转分化后，mIR132表达下调，使MeCP2蛋白能够翻译，并与PPARγ基因的5′端结合，从而促进H3K9甲基化和转录抑制因子HP1α的招募。此外，MeCP2刺激EZH2的表达，EZH2-甲基化H3K27，形成多梳阻遏物1复合物的结合位点，促进3′PPARγ外显子中的染色质凝聚。该途径的顶点是主抗纤维化基因PPARγ的转录抑制。

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