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.2009年9月29日；106(39):16805-10.
doi:10.1073/pnas.0904606106。 Epub 2009年9月16日。

HIF-2alpha在神经嵴样人类神经母细胞瘤起始细胞中保持未分化状态

亚历山大·皮埃特拉斯 1, Loen M Hansford公司, 索菲·约翰逊, 埃丝特·布里奇斯, 乔纳斯·舍伦德, 大卫·吉塞尔森, 马蒂尔达·雷恩, 西夫·贝克曼, 罗莎·诺格拉, 塞缪尔·纳瓦罗, 约格·卡蒙加, 埃里克·弗雷德隆德, 大卫·R·卡普兰, 斯文·帕尔曼
附属公司

HIF-2alpha在神经嵴样人类神经母细胞瘤起始细胞中保持未分化状态

亚历山大·皮埃特拉斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

高低氧诱导因子-2α（HIF-2alpha）蛋白水平预示神经母细胞瘤预后不良，低氧脱分化培养的神经母细胞癌细胞向神经峰样表型分化。在此，我们确定HIF-2alpha是从患者骨髓中分离出的正常毒性神经嵴样神经母细胞瘤肿瘤起始/干细胞（TICs）的标记物。在干细胞增殖条件下体外培养TIC时，HIF-2alpha的敲除降低了VEGF的表达，并诱导了部分交感神经细胞分化。HIF-2alpha-silenced细胞的异种移植瘤广泛坏死，血运不良，通过表达额外的交感神经标记物与临床神经母细胞瘤中的大部分肿瘤细胞相似，而对照肿瘤则不成熟，血运丰富，基质丰富。因此，HIF-2alpha维持神经母细胞瘤TIC的未分化状态。由于低分化与不良预后相关，血管生成对肿瘤生长至关重要，HIF-2alpha是神经母细胞瘤治疗的一个有吸引力的靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
培养的神经母细胞瘤TIC中正常毒性HIF-2α蛋白水平较高。(A类)神经母细胞瘤标本经免疫组织化学染色，检测HIF-2α和TH.*，放大区域如右侧两个面板所示。注意HIF-2α阳性细胞中实际上缺乏TH信号。(B–F类)通过qPCR测定，缺氧诱导因子-2α在正常情况下的神经母细胞瘤TICs中表达(B类)，Western blot分析(C类)和免疫组织化学(F类). qPCR检测HIF-1α在神经母细胞瘤TICs中表达(D类)，但正常氧下蛋白质通常很低(E类). 免疫组织化学显示，神经母细胞瘤TIC中HIF-2α而非TH蛋白水平较高(F类). (G公司)免疫组织化学显示，HIF-2α在培养基中有或无EGF和bFGF的常氧TICs中表达。在C类和E类，肌动蛋白充当加载控制。（比例尺：A类，50微米；F类和G公司，10微米）qPCR数据是三次独立实验的平均值。误差条代表SEM。免疫组织化学和Western blot分析数据重复至少三次。分隔线C类和E类指示同一膜或两个不同膜的两个区域已经合并。
图2。
图2。
神经母细胞瘤TIC对缺氧的反应中HIF的稳定/激活。(A类和B类)通过Western blot分析测定在1%O下生长72小时的TIC中的HIF蛋白水平2以肌动蛋白作为负荷控制。(C类和D类)已知低氧驱动基因的qPCR表达测定血管内皮生长因子和BNIP3号机组21%和1%O2. *,P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01（学生的t吨测试，双面）。(E类)Western blot分析测定TICs中雷帕霉素治疗后HIF-2α蛋白的下调。(F–H（飞行高度）)以SK-N-BE（2）c神经母细胞瘤细胞表达数据为对照，通过qPCR测定TICs中PHD的表达。qPCR数据是三次独立实验的平均值。误差条代表SEM。Western blot分析数据重复至少三次。分隔线A类和B类表示同一胶片的两个区域已合并。
图3。
图3。
人类神经母细胞瘤TIC是不成熟的，表达神经嵴/干细胞标记物。(A类)经qPCR检测，与已建立的神经母细胞瘤SK-N-BE（2）c细胞相比，神经母细胞癌TICs缺乏或极低表达交感神经分化标记物。(B类)神经母细胞瘤TIC中表达与神经嵴/干细胞表型相关的基因。(C类)经Western blotting检测，活化的Notch蛋白（icNotch）在神经母细胞瘤TICs中丰富，但在SK-N-BE（2）c细胞中不丰富。(D类)DAPT抑制γ-分泌酶活性可消除TIC中的icNotch。qPCR数据是三次独立实验的平均值。误差条代表SEM。Western blotting数据重复至少三次。
图4。
图4。
HIF-2α敲除诱导TICs早期交感神经分化。(A类)通过Western blot分析评估HIF-2α在蛋白质水平的敲除。分割线表示同一胶片的两个区域已合并。(B类)HIF2A型通过qPCR评估mRNA水平的敲除。(C类)下调血管内皮生长因子HIF-2α敲除后的mRNA。(D类)通过对shC和shHIF2A TICs核提取物的Western blot分析，icNotch-1不受HIF-2α敲除的影响。(E–G公司)通过qPCR评估HIF-2α敲除后Notch通路成分的下调。(H–J)通过qPCR评估HIF-1α敲低后交感神经分化标志物在mRNA水平上的上调。(K（K）)免疫组织化学显示HIF-2α敲除上调嗜铬粒蛋白A蛋白。(左旋-右旋)qPCR检测雷帕霉素治疗TICs后交感神经分化标记物在mRNA水平的上调。误差条代表SD(O–Q公司)qPCR检测到，雷帕霉素不会在shHIF2A细胞中诱导神经分化标记物。qPCR数据是三次独立实验的平均值，或三次独立试验的代表性数据(L–Q). 误差条代表SEM。免疫组织化学和Western blot分析数据重复至少三次。
图5。
图5。
shHIF2A TICs来源的异种移植瘤的分化增强、基质支持减少和血管化。免疫组织化学显示HIF-2α(A类)，HIF-1α(B类)、TH(C类)和CD34(D–F型)shC和shHIF2A肿瘤中的蛋白质。注意，与shHIF2A肿瘤相比，shC中的血管数量较多(D类). +, 基质区*，坏死区域。（比例尺：A–C,E类、和F类，50微米；D类，100微米）
图6。
图6。
HIF-1α与高分期负相关，但与患者预后无关。采用免疫组织化学方法对93例神经母细胞瘤患者的两个组织芯片进行HIF-1α蛋白水平检测。如前所述，将一部分阳性细胞分为四组（6）。(A类)根据国际神经母细胞瘤分期系统（INSS）确定的患者分期，分为三组递增期（INSS 1、2、4s、INSS 3和INSS 4）。HIF-1α阳性细胞数量多（分数）与患者分期低（ρ=−0.27，P（P）= 0.02). (B类)对于Kaplan–Meier生存分析，HIF-1α分数分为两组：低分数（0–25%阳性细胞）和高分数（26–100%阳性细胞）。HIF-1α染色分数水平与患者预后无显著相关性(P（P）=0.42，对数秩检验）。
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