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.2009年10月15日；183(8):5232-43.
doi:10.4049/jimmunol.0901084。 Epub 2009年9月25日。

乙醇诱导肝窦内皮细胞和人内皮细胞中ET-1和ET-BR的表达涉及低氧诱导因子-1α和microrNA-199

萨曼莎·耶利加 1, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 维杰·卡拉
附属公司

乙醇诱导肝窦内皮细胞和人内皮细胞中ET-1和ET-BR的表达涉及低氧诱导因子-1α和microrNA-199

萨曼莎·耶利加等。 免疫学杂志. .

摘要

长期饮酒会导致肝脏发炎和肝硬化。在本研究中，我们观察到来自乙醇喂养大鼠的肝窦内皮细胞（LSEC）的内皮素-1（ET-1）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和炎症细胞因子的mRNA表达比对照大鼠LSEC增加了几倍。我们也在急性乙醇处理的对照大鼠和人皮肤微血管内皮细胞的LSEC中观察到相同的结果。乙醇介导的ET-1表达涉及NADPH氧化酶和HIF-1α活化。此外，乙醇增加了Kupffer细胞和THP-1单核细胞中ET-1同源受体ET-BR的表达，这也涉及HIF-1α的激活。启动子分析和染色质免疫沉淀表明，ET-1和ET-BR近端启动子中的缺氧反应元件位点是HIF-1α结合上调其表达所必需的。我们发现，一些microRNA中的microRNAs，即miR-199，减弱了HIF-1α和ET-1的表达，而抗miR-1999逆转了这种作用，这表明乙醇诱导的miR-199-下调可能有助于增强HIF-1 alpha和ET-1表达。据我们所知，我们的研究首次表明，乙醇介导的ET-1和ET-BR表达涉及HIF-1α，与缺氧无关。此外，乙醇诱导的ET-1在大鼠LSEC中的表达受到miR-199的调节，而在人类内皮细胞中，ET-1的表达受到miR-199和miR-155的调节，这表明这些微小RNA可能作为新的负调节因子来控制ET-1的转录，从而控制ET-1的稳态水平以维持微循环。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露

作者没有经济利益冲突。

数字

图1
图1
乙醇通过NADPH氧化酶途径和HIF-1增强rLSEC中趋化因子基因的表达α. A类与对照组大鼠（C-rLSEC）相比，乙醇诱导的乙醇喂养大鼠LSEC基因表达。数据表明，与对照组相比，喂食乙醇后mRNA表达增加了一倍。B类，与未处理的rLSEC相比，乙醇处理的rLSEC中乙醇诱导的基因表达。C类，乙醇诱导HIF-1α和ET-1在乙醇处理的rLSEC中的表达，这些rLSEC与抑制剂DPI（黄素氧化酶抑制剂）、LY294002（PI3K抑制剂）或R59949（HIF-1）预先孵育α抑制剂），乙醇处理前30分钟。乙醇处理的rLSEC的定量RT-PCR数据表明，与不使用乙醇相比，使用乙醇（100 mM）刺激24小时后，mRNA表达增加了两倍。所有mRNA表达均按GAPDH mRNA水平标准化，所示数据代表三个独立实验（平均值±SD）。***，第页< 0.001;**,第页< 0.01; 纳秒，第页> 0.05.
图2
图2
乙醇通过NADPH氧化酶途径和HIF-1促进HMEC-1中趋化因子基因的表达α，需要乙醇代谢。A类，与未经处理的细胞相比，乙醇刺激HMEC-1的基因表达水平。B类，乙醇诱导HIF-1α和ET-1 mRNA在乙醇处理的HMEC-1中的表达，这些HMEC-1与抑制剂DPI、LY294002或抗坏血酸（HIF-1）预先孵育α抑制剂），乙醇处理前30分钟。C类，乙醇诱导HIF-1α和ET-1在乙醇处理的HMEC-1中的表达，该HMEC-1瞬时转染p47凤凰（phox）（NADPH氧化酶抑制剂），使用打乱的p47凤凰（phox）作为对照，在用乙醇刺激之前，PI3K呈显性负性。D类，HIF-1α和ET-1在用乙醇、乙醛或异丙醇以指定浓度和持续时间处理的HMEC-1中的表达。如有指示，HMEC-1也在乙醇处理前与4-甲基吡唑（1.0 mM）预培养30分钟。E类，乙醇诱导HIF-1α和ET-1在瞬时转染HIF-1的乙醇处理HMEC-1中的表达αsiRNA，使用干扰RNA作为对照，以及HIF-2αsiRNA，然后用乙醇处理。F类瞬时转染HIF-1的rLSEC中乙醇诱导的ET-1表达αsiRNA和scRNA在乙醇处理前的指定时间。定量RT-PCR数据表明，与不使用乙醇相比，使用乙醇（100 mM）刺激24小时后，mRNA表达增加了两倍。所有mRNA表达均按GAPDH mRNA水平标准化，所示数据代表三个独立实验（平均值±SD）。***，第页< 0.001; **,第页< 0.01; *,第页< 0.05; 纳秒，第页> 0.05.
图3
图3
乙醇通过NADPH氧化酶途径和HIF-1增强HMEC-1中ET-1的启动子活性α其影响需要乙醇代谢。A类HMEC-1中乙醇诱导的ET-1野生型全长启动子（−669 bp）和最小启动子（-176 bp）活性对乙醇（100 mM）的反应。ET-1突变型HRE（−176 bp）荧光素酶结构体的HRE在−124 bp至−121 bp处发生突变。B类，乙醇诱导ET-1最小启动子（−176 bp）活性，响应于HMEC-1的乙醇（100 mM），其中细胞在乙醇处理前与抑制剂DPI、LY294002、R59949或4-甲基吡唑（1.0 mM）预孵育30分钟（如有指示）。C类，乙醛（1.0 mM）诱导ET-1启动子（-176 bp）活性。如有指示，在乙醛处理之前，用抑制剂DPI、LY294002、R59949或4-甲基吡唑（1.0 mM）预培养细胞30分钟。荧光素酶分析数据表示为折叠变化，并且相对于未经处理的对照组荧光素素酶活性的变化和转染效率进行了标准化β-半乳糖苷酶。所示数据代表两个独立的实验（平均值±SE）。***，第页< 0.001; 纳秒，第页> 0.05.D类，乙醇诱导HIF-1的时间进程αHMEC-1核提取物中指定时间的蛋白质表达。密度分析用于确定HIF-1的折叠变化α蛋白质表达。数据标准化为β-肌动蛋白作为加载控件。E类，ET-1启动子中的HRE位点被用作探针，这表明HIF-1结合增加α在HMEC-1的核提取物中对乙醇（100 mM，24 h）的反应，如EMSA所示，当HRE位点突变时，其减弱。如有指示，HMEC-1在乙醇处理前与DPI预孵育30分钟。使用了25毫微克生物素标记的ET-1探针。如有指示，将50倍多余的冷探针添加到核提取物中。F类，乙醇诱导HIF-1的结合α通过ChIP分析评估HMEC-1的ET-1启动子上的HRE位点。如有指示，在用乙醇刺激之前，用DPI和LY294002预处理细胞30分钟。数据代表了两个独立的实验。垂直线表示重新定位的凝胶层。
图4
图4
乙醇诱导HIF-1αHIF-1调节内皮细胞中ET-1 mRNA的表达α-相关miRNAs。A类，HIF-1的3′-UTRs中miRNAs部分互补结合位点的示意图α和ET-1 mRNA。B类，乙醇诱导的HIF-1表达α-E-rLSEC中相关的miRNA水平。数据显示E-rLSEC中miRNA表达相对于C-rLSEC的倍数变化。C类，乙醇诱导HIF-1的表达α-乙醇处理的rLSEC中的相关miRNA水平。D类，乙醇诱导HIF-1的表达α-乙醇处理的HMEC-1中的相关miRNA水平。所有miRNA表达水平均标准化为miR-5S水平，所示数据代表三个独立实验（平均值±SD）。E类当转染miR-135、miR-155和miR-199过表达质粒时，乙醇诱导HMEC-1中HIF-1a和ET-1 mRNA表达的消失。F类，HMEC-1瞬时转染抗miRNAs（60 pmol），然后乙醇刺激24 h，然后HIF-1α评估ET-1 mRNA水平。G公司，rLSEC在乙醇刺激前瞬时转染抗miRNA（60 pmol），HIF-1α检测ET-1 mRNA表达。所有mRNA表达均按GAPDH mRNA水平标准化，所示数据代表三个实验（平均值±SD）。***，第页< 0.001; **,第页< 0.01; *.第页< 0.05.H（H）乙醇介导HMEC-1细胞溶质提取物中ET-1蛋白表达增加。如有指示，用抗miR-199或miR-199.的过表达质粒转染细胞。密度分析用于测定ET-1蛋白表达的倍数变化。数据标准化为β-肌动蛋白作为加载控件。
图5
图5
乙醇通过HIF-1诱导rKC和THP-1单核细胞ET-BR表达α. A类乙醇诱导的乙醇喂养大鼠Kupffer细胞ET-BR表达。数据表明，与对照组相比，喂食乙醇后mRNA表达增加了一倍。B类，乙醇诱导乙醇处理的rKC中ET-BR的表达。C类乙醇诱导的ET-BR在乙醇处理的THP-1细胞中的表达。D类用HIF-1瞬时转染THP-1细胞αsiRNA减弱乙醇处理的THP-1细胞中乙醇诱导的ET-BR表达。HIF-1型α干扰RNA被用作对照。乙醇处理的rKC和THP-1的定量RT-PCR数据表明，与不使用乙醇相比，使用乙醇（100 mM持续2 h）刺激后，mRNA表达增加了两倍。所有mRNA表达均按GAPDH mRNA水平标准化，所示数据代表三个独立实验（平均值±SD）。E类乙醇刺激THP-1细胞后，乙醇诱导的ET-BR启动子活性减弱，当两个HRE位点分别突变时。这些数据表示为折叠变化，并且相对于未经处理的对照组荧光素酶活性的变化和转染效率进行了标准化β-半乳糖苷酶。所示数据代表两个独立的实验，一式两份（平均值±D）。***，第页< 0.001; 纳秒，第页> 0.05.
图6
图6
乙醇通过内皮细胞诱导的HIF-1正反馈回路促进ET-1诱导的THP-1和Kupffer细胞MCP-1表达α激活。A类与未经处理相比，乙醇处理（100 mM，48 h）后HMEC-1释放的ET-1表现为倍变。如有指示，用DPI、LY294002和R59949预处理细胞。数据代表两个独立的实验，一式两份（平均值±SD）。B类MCP-1、ET-BR和HIF-1的mRNA表达α用乙醇处理的HMEC-1条件培养基培养THP-1细胞。如有指示，在没有或存在BQ788的情况下，用乙醇处理THP-1细胞2小时。所有mRNA表达均按GAPDH mRNA水平标准化，所示数据代表两个重复的独立实验（平均值±SD）。C类用乙醇处理rLSEC（100 mM，24 h）后释放的ET-1通过NADPH氧化酶和HIF-1介导α数据表示两个独立的重复实验（平均值±SD）。D类MCP-1、ET-BR和HIF-1的mRNA表达α在rKC中用乙醇处理的rLSEC的条件培养基培养。如有说明，rKC在没有或存在BQ788的情况下用乙醇处理12小时，或用合成ET-1（250 nm）处理。所有mRNA表达均按GAPDH mRNA水平标准化，所示数据代表两个重复的独立实验（平均值±SD）。***，第页< 0.001; **,第页< 0.01; *,第页< 0.05; 纳秒，第页> 0.05.
图7
图7
乙醇通过HIF-1正反馈回路诱导rKC中ET-1介导MCP-1表达的工作模型α在rLSEC中激活。乙醇进入rLSEC并激活NADPH氧化酶途径，产生活性氧物种。增加的活性氧物种稳定HIF-1α蛋白并激活其移位至细胞核，在那里与HIF-1异二聚体化β该复合物与ET-1启动子上的HRE结合，导致ET-1的转录增强。rLSEC释放的ET-1与同源受体ET-BR结合，ET-BR也被乙醇诱导的HIF-1上调αrKC激活。rKC中ET-1与ET-BR的结合导致MCP-1表达增加，MCP-1作为一种化学引诱剂，介导中性粒细胞从循环浸润到窦，然后进入肝脏，使乙醇诱导的肝损伤永久化。
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