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.2009年12月；21(12):1974-83.
doi:10.1016/j.cellsig.2009.09.008。 Epub 2009年9月15日。

缺乏RhoGDI的肾系膜细胞的形态和增殖异常

海克·比勒克 1, 安东尼·安塞尔莫, 西琳·德马尔迪罗西
附属机构

缺乏RhoGDI的肾系膜细胞的形态和增殖异常

海克·比勒克等人。 单元格信号. 2009年12月.

摘要

Rho GTPase活性和表达的调节对肾脏的发育和功能至关重要。Rho-GDP解离抑制剂（RhoGDI）调节Rho-GTPase活性和细胞膜循环，Rho-GDI基因敲除小鼠出现肾脏结构和功能缺陷，导致肾衰竭死亡。因此，了解导致RhoGDI（-/-）小鼠肾功能衰竭的Rho GTPase活性和细胞形态的变化非常重要。在这里，我们描述了从RhoGDI（-/-）小鼠衍生的肾系膜细胞系的特征，在该细胞系中我们验证了GDI蛋白的缺失。在没有RhoGDI的情况下，我们发现这些细胞中Rac1的比活性增加，RhoA和Cdc42 GTPase的比活性也有所增加。伴随着Rho GTPase稳态蛋白水平的代偿性降低。RhoGDI（-/-）系膜细胞的形态学分析显示，与野生型细胞相比，细胞扩散和局部接触减少。最后，RhoGDI（-/-）系膜细胞的增殖和存活能力下降。这些功能和结构变化可能导致RhoGDI（-/-）小鼠肾脏结构和功能的缺陷。

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数字

图1
图1。RhoGDI（−/−）和RhoGD（+/+）（野生型）系膜细胞（MSCs）中RhoGDI的表达水平
使用[A]抗RhoGDIα（28kD）、[B]抗D4GDI（28kD-）抗体通过Western blotting分析RhoGDI-（+/+）MSCs、RhoGDI/（−/−）MSCs和中性粒细胞的总蛋白裂解物。RhoGDI公司β/D4GDIRhoGDI（−/−）中未检测到表达(+/+)裂解物。通过对相同的膜进行免疫印迹来测定蛋白质裂解物的等载量α-肌动蛋白（44kDa）（顶部面板）。这些结果代表了三个独立的实验。
图2
图2。与野生型相比，RhoGDI（−/−）系膜细胞的异常细胞扩散表型
在纤维连接蛋白涂层玻璃盖玻片上电镀后，在30分钟、2小时、5小时和过夜（24小时）时固定RhoGDI（−/−）和RhoGDI（+/+）系膜细胞。肌动蛋白丝[A，B]用荧光标记的指骨肽（红色）染色，而细胞核[A，B]用DAPI（蓝色）染色。微管[A]和焦点接触[B]通过抗-α-微管蛋白（绿色）和抗-α-paxillin（绿色）免疫染色。[C] 为了量化细胞扩散，随着时间的推移测量阈值化的细胞面积。RhoGDI（−/−）细胞在30分钟（p<0.05）和2小时（p<0.01）的时间点扩散显著减少。结果代表三个独立实验的平均+/-SD。
图3
图3。RhoGDI（−/−）和野生型（+/+）系膜细胞群的形态学分析
将系膜细胞贴在盖玻片上，培养过夜，并用荧光标记的卵磷脂染色F-actin。在纤维连接蛋白[A，B]上生长的细胞或在其缺失的情况下生长的细胞[C，D]被分析为跛足（皱褶）和伸展长度。通过目测检查，细胞被分类为：富跛足细胞、富应力纤维细胞或收缩细胞[A，C]——每个表型的示例如[E]所示。RhoGDI（−/−）和野生型（+/+）系膜细胞群根据延伸长度进一步亚特征化[B，D]。(缩写：sR：小褶边（10-30像素长度）；mR：中等褶边（30-100像素长度）；lR：大褶边（>100像素长度）；sE：小扩展（10-50像素长度）；lE：大扩展（>100像素长度）。结果表示六个独立实验的平均+/-SD。（*，p<0.05；**，第页<0.01，来自学生t检验）。
图4
图4。RhoGDI（−/−）系膜细胞的局灶复合物丢失
在纤维连接蛋白上培养过夜的细胞染上F-actin（红色）和paxillin（绿色）以识别局部接触。显示随机选择的RhoGDI（−/−）和野生型（+/+）系膜细胞群体[A，低倍；B，高倍]。[C] RhoGDI（−/−）系膜细胞与纤维连接蛋白涂层盖玻片粘附后5小时和24小时，每个细胞的焦点接触次数减少。样品在带有40倍油浸物镜的外荧光显微镜上进行分析，并按照材料和方法中的描述进行处理。结果显示为三个独立实验的平均+/-SD（**，p<0.01，来自学生t检验）。
图5
图5。与野生型相比，RhoGDI（−/−）系膜细胞中Rac1、Cdc42和RhoA GTPase活性水平升高
如材料和方法中所述，采用标准PBD下拉试验测定RhoGDI（−/−）和（+/+）MSCs中的Rac1、Cdc42和RhoA GTPase活性。显示了每个GTPase的典型分析（下面板）。在上部面板中，活动标准化为肌动蛋白表达水平。结果以RhoGDI（−/−）中的标准化GTPase活性水平作为相对于RhoGDI+/+细胞的百分比给出。所示结果代表平均+/-SD（Rac1-GTP（n=6）、Cdc42-GTP（n=3）和RhoA-GTP（n=3）；*p<0.01，**，p<0.01，学生t检验）。
图6
图6。与野生型相比，RhoGDI（−/−）系膜细胞中Rac1、Cdc42和RhoA GTPase蛋白表达减少
通过Rac1、Cdc42、RhoA和肌动蛋白（用于蛋白质归一化）的Western blotting分析系膜RhoGDI（−/−）或wt（+/+）细胞的全细胞裂解物，然后进行密度分析。下面板显示了典型的Western blot结果。密度测定结果以RhoGDI（−/−）中的归一化GTPase表达水平相对于RhoGDI（+/+）细胞中的GTPase表达水平的百分比给出。结果显示为平均值+/-SD（Rac1（n=6）、Cdc42（n=15）和RhoA（n=5）；*p<0.01，**，p<0.01，学生t检验）。
图7
图7。RhoGDI（−/−）系膜细胞活性与汇流相关
将RhoGDI（−/−）和野生型（+/+）系膜细胞涂布在塑料上，并在存在或不存在纤维连接蛋白（FN）基质的情况下培养5天（120小时）。[a]使用材料和方法中描述的标准MTT分析法测定培养中亚流增殖24、48和72小时后的细胞活力。纤维连接蛋白基质的存在增强了RhoGDI（−/−）和野生型系膜细胞的细胞增殖和生存能力。在无FN但无FN的情况下，72小时后开始观察到细胞活力的差异。误差条代表至少三个独立实验的SEM。[B] 在FN存在下培养72小时，RhoGDI（−/−）系膜细胞能够实现100%的细胞融合；然而，培养时间越长，[C]RhoGDI（−/−）细胞活力显著降低（如凋亡相关增加所观察到的）；这在野生型细胞中也没有观察到+/-FN。
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