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.2009年9月；17(3):344-54.
doi:10.1016/j.devcel.2009.07.015。

Polo激酶和分离酶调节人类细胞中心粒复制的有丝分裂许可

孟福布莱恩祖 1, 王文静（Won-Jing Wang）, 凯利·A·乔治, Kunihiro Uryu公司, 蒂姆·斯坦恩斯, 普拉萨德五世贾勒帕利
附属公司

Polo激酶和分离酶调节人类细胞中心粒复制的有丝分裂许可

孟福布莱恩祖等。 开发人员单元格. 2009年9月.

摘要

有人提出，在后期分离依赖的中心粒分离允许中心体在下一个细胞周期进行复制。在这里，我们测试这种机制是否存在于完整的人类细胞中。在有丝分裂的退出过程中，分离酶的丧失阻碍了中心粒的脱离，并在随后的S期延迟了新中心粒的组装；然而，大多数合约最终都被解除了。我们确定Polo-like kinase 1（Plk1）是中心粒脱离的平行激活物。对Plk1的定时抑制将其关键作用期映射到G2晚期或M早期，即在后期开始安全蛋白破坏和分离酶激活之前。关键的是，当细胞在separase和Plk1下调后退出有丝分裂时，中心粒脱离完全失败，随后在间期的中心粒复制也被阻断。我们的结果表明，Plk1和分离酶在M期的不同时间起作用，允许中心体复制，这让人想起它们在从染色体中去除粘着蛋白中的作用。

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数字

图1
图1。hSeparase对M相退出期间的中心粒脱离至关重要
（A） 纯合子缺失hESPL1型生成不含hSeparase衍生多肽的细胞。hESPL1型flox/Δ通过同源重组（补充图S1）生成细胞，并感染表达Cre重组酶（AdCre）或β-半乳糖苷酶（Adβgal）的腺病毒作为阴性对照。在感染后的指定时间采集细胞，并通过免疫印迹法进行分析。与全长hSeparase（FL）和自叶N-和C-末端片段（N和C）相对应的带用箭头高亮显示。（B）hESPL1型flox/Δ中期和后期的细胞（顶部两行）和hESPL1型Δ/Δ用INCENP（黄色）、CREST抗血清（绿色）和Sgo1（红色）抗体对后期未分离的细胞（AdCre感染48小时后）进行染色。（C和D）hESPL1型flox/Δ用时间扫描显微镜追踪感染Adβgal（C）或AdCre（D）的细胞。固定和染色后，对2至6小时前退出有丝分裂的细胞进行重新定位，并对中心粒与抗中心蛋白（绿色）和抗C-Nap1（红色）抗体的结合进行评分。用DAPI（蓝色）观察细胞核。（E） C和D的量化误差条表示三个独立实验的标准偏差。（F） A类hESPL1型Δ/Δ用时间扫描显微镜通过M期出口追踪细胞，渗透，并用抗中心蛋白和抗C-Nap1抗体染色。箭头和箭头分别表示中心粒和中心集合体。获取荧光图像后，固定同一细胞并进行电子显微镜处理。电子显微照片以三种不同的放大倍数显示，以便于图像之间的关联和中心极结构的可视化。方框1突出显示了电子密度中心蛋白聚集体的两个连续截面；方框2，两对啮合的中心粒。
图2
图2。中心柄脱离需要hSeparase介导的蛋白水解，但不需要姐妹染色单体分离
（A） 表达不可清除Scc1（Scc1）的HeLa细胞数控)如图1所示，通过相关时间戳免疫荧光显微镜对四环素调节启动子进行分析。顶行和底行在两个不同的焦平面中显示分离的中心粒。（B） hSeparase转基因的Cre重组酶依赖表达策略。（C）hESPL1型flox/Δ携带所示转基因的细胞被AdCre或Adβgal感染，并用hSeparase C末端特异性单克隆抗体进行免疫印迹分析。星号表示分解产物。使用Tubulin来确认相等的负载。（D） AdCre感染96小时后，用流式细胞仪分析C细胞。显示了对应于二倍体（2N）、四倍体（4N）、八倍体（8N）和十六倍体（16N）DNA含量的峰值。（E、F）hESPL1型Δ/Δ通过相关的延时免疫荧光显微镜检查表达野生型（WT）或蛋白酶死亡（CS）分离酶的细胞，如A所示。（G）E和F的定量。误差条表示三个独立实验的标准偏差。
图3
图3。许多中心粒最终脱离并复制hESPL1-空细胞，揭示第二条许可途径的存在
（A） 实验方案。异步hESPL1型flox/Δ用Adβgal或AdCre感染细胞，并用时间扫描显微镜进行追踪。用1小时的BrdU脉冲标记退出有丝分裂并进行G1/S转换的细胞，然后在无BrdU培养基中追踪4小时。然后固定细胞并用中心蛋白、C-Nap1和BrdU抗体染色，然后检查S期中心粒脱离和/或复制的证据。（B） 一双hESPL1型flox/Δ显示完全中心粒脱离（2个C-Nap1病灶）和复制（4个中心粒病灶）的细胞。（C-E）Centriole配置hESPL1型Δ/Δ细胞。（C） 无中心粒脱离或初始中心粒脱离（2个C-Nap1病灶），无重复（4个中心粒病灶）。（D） 异步分离（3个C-Nap1焦点）和复制（5个或6个中心焦点）。（E） 完全脱离（4个C-Nap1病灶）和重复（8个中心蛋白病灶）。（F） S/G2相中心粒构型的量化。误差线表示三个独立实验的标准偏差。
图4
图4。Plk1在有丝分裂早期起作用，促进中心粒脱离
（A） 实验方案。在用Plk1抑制剂BI-2536（BI）或Eg5抑制剂红曲醇作为对照的3小时处理期间拍摄异步增殖细胞。我们注意到，在G2晚期或前期，Plk1失活激活纺锤体组装检查点，并使细胞停滞在前中期。相反，中晚期有丝分裂Plk1失活并不阻止后期发病，而是抑制胞质分裂。为了分析两种治疗方案下的中心粒复制潜能，使用Cdk1选择性抑制剂RO-3306（RO）诱导前群体中的细胞退出有丝分裂。用BrdU脉冲标记法标记经过S期的细胞，并如图3所示进行分析。（B） A类hESPL1型flox/Δ在M期晚期（200 nM）用BI处理的细胞表现出完全的中心粒脱离（4个C-Nap1病灶）和重复（8个中心蛋白病灶）。（C） A类hESPL1型flox/Δ在G2晚期（200 nM）用BI处理的细胞，显示无脱离（2个C-Nap1病灶）和无重复（4个中心蛋白病灶）。（D） A第1页作为在G2晚期用3MB-PP1（10 mM）处理的细胞（RPE1，视网膜色素上皮人类细胞），显示无脱离（2个C-Nap1病灶）和无重复（4个中心蛋白病灶）。（E） A类hESPL1型flox/Δ在G2晚期用monastrol（50μM）处理的细胞表现出完全脱离（4个C-Nap1病灶）和复制（8个中心蛋白病灶，其中一个位于不同的焦平面（未显示））。（F） B-E中结果的量化误差条表示三个独立实验的标准偏差。
图5
图5。Separase和Plk1调节中心粒复制的有丝分裂许可
（A） G2相hESPL1型Δ/Δ用25 nM BI处理细胞，用RO诱导细胞退出有丝分裂，用BrdU标记S期转运。中心柄保持接合（2个C-Nap1病灶），无法复制（4个中心蛋白病灶）。（B） hSeparase、Plk1或两种调节因子下调后中心粒重复的定量。误差线表示三个独立实验的标准偏差。（C，&D）G2相hESPL1型Δ/Δ（C） 和hESPL1型flox/Δ（D） 分别用BI 200 nM或25 nM处理细胞，用RO诱导细胞退出有丝分裂，并用中心蛋白和C-Nap1抗体染色。然后对每个细胞进行连续切片和电子显微镜检查。（E） 较晚的S/G2阶段hESPL1型flox/Δ在先前的G2/M期用BI 200 nM处理的细胞用中心蛋白、C-Nap1和BrdU抗体染色，然后连续切片。电子显微照片以三种不同的放大倍数显示，以便于图像和中心粒结构细节（箭头）之间的关联。
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