Proteomics analysis reveals novel components in the detergent-insoluble subproteome in Alzheimer's disease

doi:10.1021/pr900474t

.2009年11月；8(11):5069-79.

doi:10.1021/pr900474t。

蛋白质组学分析揭示了阿尔茨海默病洗涤剂不溶性亚蛋白组中的新成分

Yair M Gozal公司¹, Dung先生, 马拉齿轮, 程冬梅, 约翰·J·汉菲尔, 克里斯托弗·芬德伯克, 彭俊敏, 詹姆斯·J·拉, 艾伦·利维

附属公司

PMID： 19746990
预防性维修识别码：项目经理2784247
DOI（操作界面）： 10.1021/pr900474吨

蛋白质组学分析揭示阿尔茨海默病洗涤剂不溶性亚组分中的新成分

Yair M Gozal公司等。蛋白组学研究杂志. 2009年11月.

.2009年11月；8(11):5069-79.

doi:10.1021/pr900474t。

作者

雅伊尔·戈扎尔¹, Dung先生, 马拉齿轮, 程冬梅, 约翰·汉菲尔特, 克里斯托弗·芬德伯克, 彭俊敏, 詹姆斯·J·拉, 艾伦·利维

附属

¹美国佐治亚州亚特兰大市埃默里大学神经病学系，邮编30322。

PMID： 19746990
预防性维修识别码：项目经理2784247
DOI（操作界面）： 10.1021/pr900474吨

摘要

神经退行性疾病通常在病理学上定义为蛋白质聚集体的存在。这些聚集物，包括阿尔茨海默病（AD）中的淀粉样斑块，是蛋白质异常积累和加工的结果，可能最终导致神经元功能障碍和细胞死亡。迄今为止，传统的生物化学研究已经揭示了蛋白质聚集体中丰富的核心成分。然而，快速改进的蛋白质组学技术提供了重新审视病理聚集成分的机会，并识别参与神经退行性变的不太丰富但潜在重要的功能分子。本研究的目的是建立一种蛋白质组学策略，用于分析神经退行性疾病组织中特定疾病的蛋白质丰度变化。使用高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），我们分析了AD和未受影响的对照病例中不溶于洗涤剂的额叶皮层样品。此外，我们分析了额颞叶退行性变（FTLD）病例的样本，以确定其他神经退行性疾病中不存在的AD特异性变化。我们使用无标记定量技术，根据相应离子的提取离子电流（XIC）比较样品中已识别肽的丰度。在512个已鉴定的蛋白质中，定量显示81个AD特异性蛋白质发生了显著变化。在额外的人工过滤后，与对照组和FTLD大脑相比，AD中增加了11种蛋白质，包括β-淀粉样蛋白、tau和载脂蛋白E，这些蛋白质都是公认的AD-linked蛋白质。此外，我们鉴定并验证了洗涤剂不可溶部分中丝氨酸蛋白酶15、锚蛋白B和14-3-3 eta的存在。我们的结果为蛋白质组学应用的能力提供了进一步的证据，以确定AD中疾病特异性蛋白质的保守组，增强我们对疾病发病机制的理解，并为开发有效治疗该疾病和其他破坏性神经退行性疾病的新候选药物。

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数字

**图2。蛋白质组分析样品制备**
（A）样品制备和“自下而上”蛋白质组学分析的策略图，其中蛋白质被消化成肽以改进分离和电离。（B）用考马斯蓝G-250染色的分离尿素组分的SDS-PAGE凝胶。如图所示，将凝胶层切成5块。

**图3。蛋白质组学数据的统计评估和过滤**
（A）转换所有凝胶带中所有蛋白质AD/Control比较的丰度比（以对数为基数2），并绘制每个点对应于0.3个单位窗口中的蛋白质数量（黑线）。随后将高斯曲线拟合到数据（红线），并用于确定蛋白质变化的显著性水平。（B）与（C）统计平均值、标准偏差和回归系数进行所有可能情况比较的拟合正态分布。（D）去除假阳性的附加筛选标准基于通过对相应肽进行手动评分的蛋白质定量质量评估。得分最高的蛋白质在上述各类别中各得1分，总共得3分。序号，信噪比。

**图3。蛋白质组学数据的统计评估和筛选**
（A）转换所有凝胶带中所有蛋白质AD/Control比较的丰度比（以对数为基数2），并绘制每个点对应于0.3个单位窗口中的蛋白质数量（黑线）。随后将高斯曲线拟合到数据（红线），并用于确定蛋白质变化的显著性水平。（B）与（C）统计平均值、标准偏差和回归系数进行所有可能情况比较的拟合正态分布。（D）去除假阳性的附加筛选标准基于通过对相应肽进行手动评分的蛋白质定量质量评估。得分最高的蛋白质将在上述每一类别中获得1分，共计3分。序号，信噪比。

**图4。通过免疫印迹分析确认蛋白质组候选**
通过诊断汇总FTLD-U、AD和未受影响的对照病例的额叶皮层，并用含有triton X-100、sarkosyl和尿素的缓冲液依次提取。用抗体（A）Tau2免疫印迹法对肉豆蔻不溶物（尿素）样品进行免疫印迹，该抗体可识别非磷酸化和异常磷酸化的tau（区域显示为~30kD–60kD）（B）载脂蛋白E（36kD用箭头表示）（C）14-3-3η（28kD用箭表示）（D）丝氨酸蛋白酶15（106kD由箭头表示）和（E）Ankyrin B（205kD、163kD和100kD处的多个亚型用箭头表示）（F）进行代表性Ponceau S可逆膜染色，以确保凝胶中蛋白质的均匀负载和完全转移。（G）未冷却的AD（n=10）和对照组（n=100）分别用洗涤剂提取，并用14-3-3η抗体进行免疫印迹。显示了相应的Ponceau S可逆膜染色。（H）免疫反应性14-3-3η带的定量显示，该蛋白在AD尿素提取物中的富集倍数为2.1倍(第页< 0.01).

**图5。额叶皮层浮动切片（50μm）中蛋白质组候选物的免疫组织化学确认**
（A）对照组织（200μm）和（B）AD（100μm）的载脂蛋白E染色。（B）对照组织（200μm）和（B）AD（200μm）中的锚蛋白B染色。（C）对照组织14-3-3η染色（200μm）和（B）AD染色（100μm）。*（比例尺，单位：μm）*

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