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.2009年11月；158(2):186-98.
doi:10.1111/j.1365-2249.2009.04003.x。 Epub 2009年7月17日。

延长微管破裂增强慢性淋巴细胞白血病细胞的免疫原性

S P沙哈 1, J托米奇, Y Shi先生, T Pham公司, P梅罗, D白色, L He公司, J·L·巴里扎, P A Wender先生, J W展位, D E扳手
附属公司

延长微管破裂增强慢性淋巴细胞白血病细胞的免疫原性

S P沙哈等。 临床实验免疫学. 2009年11月.

摘要

尽管激活了高免疫原性细胞所使用的许多信号通路，但细胞毒性化学疗法通常不会介导肿瘤中免疫原性基因程序的表达。同时使用可调节和补充化疗药物激活的应激信号通路的药物可能会增强癌细胞的免疫原性，增加其对T细胞介导的对照的敏感性，并导致更高的临床缓解率。与这一假设一致，微管抑制剂长春新碱导致慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞迅速死亡，而不会增加其免疫原性。蛋白激酶C（PKC）激动剂（如bryostatin）延迟了长春新碱处理的CLL细胞的死亡，使其具有高度免疫原性，增加了混合淋巴细胞反应的刺激能力、促炎细胞因子的产生、共同刺激分子的表达和C-Jun N末端激酶（JNK）的激活，p38和核因子κB（NF-kappaB）信号通路。这种表型类似于通过Toll样受体（TLRs）激活CLL细胞的结果，TLRs传递来自感染性病原体的“危险”信号。PKC激动剂和微管抑制剂用于模拟TLR信号，并提高CLL细胞的免疫原性，这对化学免疫治疗策略的设计具有指导意义。

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数字

图4
图4
长春新碱对二丁酸佛波酯（PDB）治疗的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞共刺激分子表达的影响。将来自8名不同患者的纯化CLL细胞单独培养或与长春新碱（3µg/ml）±PDB（10 ng/ml）共同培养4天。然后用流式细胞术检测CD80、CD86、CD54和CD83的表达。（a） 图中显示了患者31的一个典型示例。右上象限中的数字是CD80的百分比+单元格（顶部面板），右下象限中的数字是CD83的百分比+电池（顶部面板）和CD86+单元（右面板），分别在指定条件下。（b） CD80百分比的平均值和标准误差+，CD86+和CD83+从6个患者样本中测定培养期结束时的细胞和表达的平均荧光强度（MFI）（未显示）。对于CD54，只显示MFI（除以10），因为基本上所有CLL细胞都表达该分子。双头箭头上的数字是P（P）-样本平均值之间的差异值。
图1
图1
长春新碱对白血病细胞存活和共刺激分子表达的影响。（a） 将纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞与不同浓度的长春新碱、含或不含二丁酸佛波酯（PDB）（10 ng/ml）培养2天。然后收集细胞，用7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色，并用流式细胞仪进行分析。7AAD的百分比+细胞被用来表示死亡细胞，活细胞的百分比通过从100中减去这个数字来确定。显示了所示患者人数结果的平均误差和标准误差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. （b） 在排除7AAD的CLL细胞上测定CD80、CD86、CD54和CD83的表达。CD80百分比的平均值和标准误差+，第86页+和CD83+从6个患者样本中测定培养期结束时的细胞和表达的平均荧光强度（MFI）（未显示）。对于CD54，只显示MFI（除以10），因为基本上所有CLL细胞都表达该分子。长春新碱降低了分析时仍存活的CLL细胞上所有四种分子的表达。双头箭头上的数字是P（P）-样本均值之间显著差异的值。（c） PDB和picolog保护作用的剂量依赖性。用长春新碱（3µg/ml）和不同稀释度的PDB和picolog培养CLL细胞。PDB和picolog的初始浓度分别为100 ng/ml和80 ng/ml。2天后，用7AAD染色测定活细胞百分比。图中显示了图例中所示患者编号结果的平均误差和标准误差。（d） CLL细胞用长春新碱（3µg/ml）、PDB（100 ng/ml）或PDB加长春新汀培养。在第1、2、3和5天，在血细胞仪中对排除台盼蓝的活细胞进行计数，并将该数量标准化为单独培养的活CLL细胞的数量。显示了每个时间点相对细胞数的平均值和标准误差（不同患者样本的数量(n个)分别=第1、2、3和5天的6、3、5和3）*P（P）<0.05。
图2
图2
长春新碱对微管细胞骨架和细胞活力的影响。用二丁酸佛波酯（PDB）（10 ng/ml）、长春新碱（3µg/ml）或两者处理细胞48 h，然后按照材料和方法中的描述制备显微镜。（a） 抗β-微管蛋白染色的共焦图像。比例尺对应5µm。（b） 4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色的表观荧光图像。顶行显示了通过微分干涉对比（DIC）显微镜检查的细胞。比例尺对应5µm。
图3
图3
信号转导和蛋白激酶C同工酶抑制剂对二丁酸佛波酯（PDB）和长春新碱处理的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞存活的影响。纯化的CLL细胞与之前优化浓度的抑制剂（a）U0126[有丝分裂原活化蛋白细胞外信号相关激酶（MEK）抑制剂]（20µM）、SP600125[c-Jun N末端激酶（JNK）抑制剂]10µM、SB203580（p38抑制剂）（2µM（15µg/ml）和U0126和地塞米松。（b） G06976（经典PKC同工酶抑制剂）（1µM）、罗氏菌素（PKCδ抑制剂）（3µM，或G06976+罗氏菌肽），然后用PDB（100 ng/ml）和长春新碱（3μg/ml）刺激。48小时后，通过7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色检测培养物中残留的活细胞，并与单独用长春新碱（Vcr）激活的培养物、单独用PDB激活的培养液、单独用长春新碱（PDB+Vcr）活化的培养物或单独培养的细胞进行比较。注意，在这段时间内，在这些浓度下，抑制剂单独对CLL细胞没有毒性。显示了所示患者数量的CLL细胞结果的平均误差和标准误差。P（P）-值显示在双头箭头上。（c） 为了证实抑制剂的特异性及其对细胞外调节激酶（ERK）和NF-κB活性的影响，在刺激1小时后进行细胞裂解，并测定磷酸化肉豆蔻酰化丙氨酸丰富蛋白激酶c底物（MARCKS）、磷酸化和非磷酸化形式的ERK和抑制剂κB（IκB）的水平然后通过免疫印迹法测定。用六个不同的患者样本重复实验，结果相似。
图5
图5
长春新碱和二丁酸佛波酯（PDB）对肿瘤坏死因子（TNF）-α产生的影响。（a） 将来自两名不同患者的纯化慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞单独培养，或用长春新碱（3µg/ml）、PDB（10 ng/ml）、PDB和长春新汀或S28690（1µg/ml）刺激。1小时后，通过实时聚合酶链反应（PCR）测定TNF-αmRNA转录物[相对于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）转录物]。每个患者的结果都表明，PDB和长春新碱联合使用在诱导TNF-α信息方面与S28690一样有效。（b） 用长春新碱、PDB、长春新汀和PDB或S28690（用于比较）以及TNF-α转化酶抑制剂（TAPI）处理纯化的CLL细胞。4h后，用流式细胞术检测细胞膜TNF-α（mTNF-β）的表达。显示了患者76的一个例子，其中使用双色染色来揭示CD83表达的伴随变化。（c） 四个不同患者样本的结果总结表明，长春新碱增加了PDB-激活的CLL细胞的TNF-α生成，通常达到了用bona-fide Toll样受体（TLR）激动剂（S28690）获得的水平。统计显著性(P（P）<0·05）通过使用配对t吨-测试。（d） 如材料和方法中所述，在活化48小时后，测量来自另外6个患者样本的培养上清液中的TNF-α水平。
图6
图6
长春新碱和二丁酸佛波酯（PDB）对T细胞活化和对裂解效应物敏感性的影响。（a） 刺激剂慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞是通过用长春新碱（3µg/ml）、PDB（10 ng/ml）、PDB和长春新汀或PDB和S28690（0.1µg/ml）激活3-4天而获得的，并且是在同一时期单独培养的CLL细胞（标记为“无”），这些细胞来自四个不同的患者，用于刺激异基因T细胞。使用阿拉玛蓝染色法（光密度（OD））在5-6天后测定T细胞增殖540-595纳米]. 显示了三份混合淋巴细胞反应（MLR）培养物的平均值和标准误差（从仅含有T细胞和刺激物的对照孔中减去背景值后）。不同的符号表示来自单个患者的刺激器的结果。（b） 将葡萄球菌肠毒素A（SEA）反应性T细胞和5,6-羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CLL细胞[单独培养62 h，与PDB（100 ng/ml）或PDB和长春新碱（1µg/ml）混合培养4 h，并在SEA存在下培养。然后按照材料和方法中的描述，通过流式细胞术测定靶细胞死亡。右面板中显示了效应器与目标比率为1:3的典型示例（患者23）。点图中的数字是右上象限和右下象限中细胞百分比的总和，代表濒死CLL细胞的总百分比。左侧面板显示了这段时间内自然死亡的数量。（c） 图中显示了四个不同患者样本的结果。显示了每种情况下死亡细胞的净百分比（从SEA介导的杀伤中减去背景）。这个P（P）-值（成对获得t吨-试验）表明，虽然PDB可以防止经长春新碱处理的细胞死亡，但与未经处理的CLL细胞或单独用PDB处理的细胞相比，这些细胞对裂解效应物更加敏感。
图7
图7
长春新碱和二丁酸佛波酯（PDB）对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞免疫原信号的协同作用。（a） 纯化的CLL细胞单独培养，加入3µg/ml或10µg/ml长春新碱、10 ng/ml PDB、PDB和长春新汀（3µ/ml或10μg/ml）或（用于比较）PDB和0.1µg/mlS28690。1 h后，通过免疫印迹法测定c-Jun N末端激酶（JNK）、p42/44细胞外调节激酶（ERK）、肉豆蔻酰化丙氨酸丰富蛋白激酶c底物（MARCKS）、p38和抑制剂κB（IκB）磷酸化状态的变化。首先用磷酸特异性抗体检测印迹，然后用泛特异性JNK、p42/p44或p38抗体（未显示）或β-肌动蛋白抗体作为负荷对照进行剥离和再检测。从患者79中获得的结果代表了另外七个患者样本。（b） 蛋白激酶C（PKC）激动剂和长春新碱治疗后介导CLL细胞免疫原性的信号相互作用模型。单药长春新碱或PDB激活信号通路，其本身不足以产生强免疫原性，但结合后可重建与高免疫原性细胞相关的信号特性（例如，由PDB和Toll样受体7激动剂激活）。
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