CBP-mediated acetylation of histone H3 lysine 27 antagonizes Drosophila Polycomb silencing

doi:10.1242/dev.037127

.2009年9月；136(18):3131-41.

doi:10.1242/dev.037127。

CBP介导组蛋白H3赖氨酸27乙酰化拮抗果蝇多梳沉默

冯铁¹, 拉基·巴纳吉, 卡尔·A·斯特拉顿, 贾亚什雷·普拉萨德·西尼亚, 文森特·斯蒂芬尼克, 安德烈·兹洛宾, 曼努埃尔·O·迪亚兹, 彼得·C·斯卡切里, 彼得·J·哈特

附属公司

PMID： 19700617
预防性维修识别码： PMC2730368型
内政部： 10.1242/dev.037127

CBP介导组蛋白H3赖氨酸27乙酰化拮抗果蝇多梳沉默

冯铁等。开发. 2009年9月.

.2009年9月；136(18):3131-41.

doi:10.1242/dev.037127。

作者

附属

¹凯斯西储大学遗传学系，美国俄亥俄州克利夫兰44106。fxt8@case.edu

PMID： 19700617
预防性维修识别码： PMC2730368型
内政部： 10.1242/dev.037127

摘要

Polycomb抑制复合物2（PRC2）对组蛋白H3赖氨酸27（H3K27me3）的三甲基化对Polycomm靶基因的转录沉默至关重要，而H3K27（H3G27ac）的乙酰化最近被证明与许多活跃的哺乳动物基因相关。与组蛋白乙酰转移酶CBP相关的三胸蛋白（TRX）是维持转录活性状态和拮抗多囊沉默所必需的，尽管这种拮抗的机制尚不清楚。在这里，我们表明H3K27被果蝇CBP特异性乙酰化，其脱乙酰化涉及RPD3。H3K27ac在早期胚胎中含量较高，4小时后随着H3K17me3的增加而下降。E（Z）的敲除降低了体组蛋白和被抑制的Polycomb靶基因abd-A的启动子中的H3K27me3并增加了H3K17ac，这表明这些确实构成了一些H3K27位点的替代修饰。体内CBP的适度过度表达导致H3K27ac的整体增加和H3K17me3的减少，并强烈增强Polycomb突变表型。我们还表明，H3K27乙酰化需要TRX。TRX过度表达还导致H3K27ac增加，H3K17me3随之减少，并导致Polycomb沉默缺陷。染色质免疫沉淀结合DNA微阵列（ChIP-ChIP）分析表明，H3K27ac和H3K17me3相互排斥，H3K27ac与H3K4me3信号在大多数位点一致。我们认为，通过CBP对H3K27进行TRX依赖性乙酰化，可以在Polycomb靶基因上阻止H3K27me3，并构成TRX拮抗或阻止Polycomm沉默的分子机制的关键部分。

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数字

**图1。**
**H3K27被乙酰化*果蝇属*美国海关与边境保护局。**(A类)西部小牛胸腺的斑点（顶部两个面板）和考马斯蓝染色（底部）组蛋白（通道1），重组*果蝇属*H3和H4来自*E.公司。大肠杆菌*（车道2）和*果蝇属*胚胎组蛋白（0-22小时，3车道和4）用酸（a）或高盐萃取。星号标记N-末端降解的H3。(B类)整个S2细胞提取物的蛋白质印迹用CBP或GCN5 dsRNAs治疗5天后（第3和第4道）。重组（未修饰）H3来自*大肠杆菌*在5号车道上作为一般控制用于修饰特异性抗体。β-微管蛋白和组蛋白H3（c和h）用作装载控制。(C类,天)蛋白质印迹瞬时转染后的整个S2细胞提取物共表达（C）全长CBP和GST-H3（野生型或K27Q突变型）或（D）截断襟翼-CBP【CBPΔN和CBP△（N+HAT）】和GST-H3。内源性H3K27ac在1-4车道强烈检测到（未显示）。(E类)in的免疫印迹使用纯化的FLAG-CBPΔN（通道3）和FLAG-p300（6号和7号车道）。通道1是输入基板（未经修改的H3大肠杆菌)而通道2是使用反FLAG纯化的并行控制来自未转染S2细胞的部分。通道4（胚胎组蛋白）用作阳性对照。两个星号表示C末端降解的H3。

**图2。**
**RPD3参与组蛋白H3K27ac的脱乙酰化。**西部S2细胞提取物的分析，按照图1B，拆除后CBP、SIR2、RPD3和CREB2（如上各2-6车道所示），证明每次击倒对(A类)左侧列出的蛋白质水平和(B类)组蛋白H3修饰水平列于右侧。前两名B中的面板显示了相同抗H3K27ac西药的不同暴露。β-微管蛋白和H3作为负荷控制。

**图3。**
**胚胎发生期间H3K27ac和H3K17me3的互补变化。**组蛋白H3的西方分析*果蝇属*胚胎如图所示的高盐。1B、。胚胎年龄（产卵后数小时）显示在上述各项中车道。车道3中K27me2和K27me1以下的频带部分降级为H3。在0-4小时胚胎，H3K27me3只能在4倍浓缩液中检测到摘录（未显示数据）。

**图4。**
**E（Z）的敲除导致H3K27me3和H3K27交流。**(A类)不同数量S2细胞的西方分析（0.15、0.3和45万个细胞），未经处理（1-3车道）或E（Z）之后击倒（4-6车道）。注意H3K27me3和H3K17me2的减少以及击倒后H3K27ac增加。右边的两条车道显示效率很高E（Z）的耗尽。(B类)全S2细胞提取物的西方分析（1-3车道）和对照组的成虫提取物(*周¹¹¹⁸*,通道4）并从*hs-E（z）*转基因在29°C下培养（泳道5）。车道1，未经处理的细胞；车道2，对照敲低（GFP）；车道3，E（Z）部分击倒。注意残留物E（Z）和H3K27me2存在于对照水平。(C类)减少H3K27me3和H3K17ac在*阿卜杜勒-A*之后的启动程序击倒E（Z）。ChIP效率，以输入DNA的百分比表示通过免疫沉淀回收，通过实时PCR测定，结果显示适用于E（Z）、CBP、H3K27me3和H3K17ac。兔免疫前血清用作背景控制。信号与背景的比率显示在每列底部（左侧面板）。两个独立ChIP的平均值和标准差显示了实时PCR。请注意，E（Z）和H3K27me3在*阿卜杜勒-A*启动子（左）高于背景（2.6倍和7.6倍，在未经处理的S2细胞中（灰色），但分别降至1.3和2.7E（Z）击倒后乘以背景（黑色）。在转录区*阿卜杜勒-A*在未经处理和E（Z）敲低S2细胞中，E（Z和H3K27ac未显著高于背景（右侧面板），表示他们不在。

**图5。**
**CBP的敲除或过度表达导致H3K27ac和H3K17me3。**(A类,B类)组蛋白和蛋白质的西方分析CBP被（A）中度敲除的成虫蛋白质被RNAi关闭(*hsp70-GAL4型*/+;*UAS-CBP RNAi*/+)或（B）适度过度表达(*hsp70-GAL4型*/+;*UAS-CBP公司*/+)（车道2）。仅表达GAL4的苍蝇(*hsp70-GAL4型*)用作控制（车道1）。CBP使H3K27me3水平（相对于总H3）降低了约30%过表达，由Li-Cor成像仪测定。符合美国海关与边境保护局敲除结果显示，适度的CBP过度表达也增加了H3K18ac（B中的车道2），但不是K23ac、K14ac或K9ac。(C类)小型由更强的眼部特异性CBP过度表达引起的粗糙眼部表型是被E（Z）的同时过度表达所抑制。眼睛如（a）a所示野生型控制(*周¹¹¹⁸*)，（b，d）CBP过表达和（c，e）如图所示，在29°c和18°c下使用CBP+e（Z）过表达器。纯合子*hs-E（z）*在29°C下饲养的苍蝇具有野生型眼睛（未显示）。

**图6。**
**H3K27乙酰化需要TRX。**(A类)多烯温度敏感的染色体*信托收据¹*突变体在允许温度（18°C）或限制温度（29°C）下生长在相同条件下用顶部显示的抗体染色每个面板。染色体DAPI共染色（左栏）抗TRX抗体（第二列），表明一般染色体结构似乎未受*信托收据¹*突变。这个两个右侧面板显示与豚鼠抗CBP同时染色和兔抗H3K27ac抗体；这两个信号看起来与单独使用抗CBP或抗H3K27ac染色的制剂（数据不如图所示）。(B类)成人组蛋白提取的西方分析*信托收据¹*具有总H3和H3特异性抗体的苍蝇如图所示，翻译后修改的H3。CBP级别出现在中保持不变*信托收据¹*29°C下的突变（数据未显示）。(C类)来自对照（顶部）和TRX过度表达的多烯染色体(*da-GAL4号机组*驱动器，底部）幼虫染色如在A(天)西部对照果蝇组蛋白的提取分析(*hs-GAL4型*，车道1）以及在*hs-GAL4型*驱动程序位于29°C（车道2）。

**图7。**
**多梳消声模型及其动态调节。**(A类)H3K27的酶反应总结。(B类)PRC2和RPD3升级脱乙酰H3K27ac和三甲基H3K27（蓝色卵圆）位于启动子核小体上，由含PC的PRC1结合。TRX、CBP和UTX合作通过去甲基化和启动子核小体乙酰化H3K27（红色方块）并刺激通过H3K4的三甲基化转录（红色椭圆形）。五个核小体所显示的代表非活性（左）或活性（右）基因。

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1. Ahmad，K.和Henikoff，S.（2002年）。组蛋白变体H3.3通过复制无关的核小体组装标记活性染色质。分子细胞9，1191-1200。-公共医学
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