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.2009年9月3日；583(17):2749-57.
doi:10.1016/j.febslet.2009.07.058。 Epub 2009年8月6日。

一种由CD74和CXCR4形成的功能性异聚MIF受体

维雷娜·施瓦茨 1, 红旗路, 桑德拉·克莱默, 乔安娜·科尔贝尔, 里贾娜·克罗恩, 金·奥尔, 理查德·布卡拉, 克里斯蒂安·韦伯, 尤尔根·伯恩哈根
附属公司

一种由CD74和CXCR4形成的功能性异聚MIF受体

维雷娜·施瓦茨等。 FEBS信函. .

摘要

MIF是一种趋化因子样炎症介质，通过与CXCR2和CXCR4结合触发白细胞募集。MIF还与CD74/不变链（一种单程膜受体）相互作用。我们确定了CD74和CXCR2之间的复合物在白细胞募集中起作用。尚不清楚CD74是否也与CXCR4结合。我们证明了当CD74与CXCR4在HEK293细胞中表达时，CD74/CXCR4复合物形成。缺乏ER抑制信号的CD74变异表达表明CD74/CXCR4复合物位于细胞表面。重要的是，内源性CD74/CXCR4复合物是通过联合免疫沉淀法从单核细胞中分离出来的。最后，MIF刺激的CD74依赖性AKT激活被抗CXCR4和抗CD74抗体以及AMD3100阻断，而CXCL12刺激的AKT激活没有被抗CD74减少。因此，CD74与CXCR4形成功能复合物，介导MIF特异性信号。

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图1
图1
过度表达后MIF受体融合蛋白的细胞表面表达。融合蛋白HA-CXCR4、V5-CD74、CD74minRTS以及YFP-CD74minRTS和CXCR4-CFP在HEK293细胞中体外表达。（a） 表达HA标记CXCR4的HEK293细胞的流式细胞术直方图。比较抗CXCR4染色细胞（绿色）和FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。（b） 表达V5标记CD74的HEK293细胞的流式细胞术直方图。比较抗CD74染色细胞（红色）和FITC-IgG染色细胞（灰色）。（c） 表达CD74minRTS的HEK293细胞的流式细胞术直方图。将抗CD74染色的细胞（红色）的荧光强度与用FITC-IgG染色的细胞（灰色）的荧光强度进行比较。注：CD74中ER滞留信号的缺失增强了CD74的细胞表面表达（与c和b相比）。（d） CXCR4-CFP和YFP-CD74minRTS在HEK293细胞中的克隆化。使用Axiover 100M/Zeiss LSM510共焦显微镜进行荧光显微镜分析。箭头表示细胞表面CXCR4-CFP和YFP-CD74minRTS之间存在强共定位点。箭头+星号表示有明显的细胞内共定位点（可能是溶酶体内）。底部的细胞在整个质膜上显示出共定位。
图2
图2
通过共免疫沉淀揭示过表达的CXCR4和CD74的蛋白质复合物形成。HA-CXCR4和V5-CD74融合蛋白或HA-CXCR与CD74minRTS蛋白在HEK293细胞中体外表达。（a，左）用抗V5抗体免疫沉淀V5-CD74，用抗HA或抗CXCR4抗体检测共沉淀CXCR4。（a，右）为CD74开发的对照印迹。（b，左）如（a）所示的反向设置，用抗HA抗体进行免疫沉淀，用抗V5抗体进行免疫印迹。（b，右）通过抗HA或抗CXCR4抗体为CXCR4开发的对照印迹。（c，左）设置如（b）所示，但转染pCD74minRTS并用抗CD74抗体形成印迹。（c，右）针对CXCR4开发的对照印迹。仅用珠子进行对照免疫沉淀（对照）；输入通道表明对5%的相应HEK293裂解产物进行了Western blot分析。分子量标准品在相同的凝胶（Mr）中电泳。免疫沉淀；WB、Western blot。表明次级WB抗体对免疫球蛋白重链（IgG-HC）和轻链（Ig G-LC）进行了非特异性染色。请注意，抗HA抗体是一种较差的WB抗体；因此，CXCR4的输入控制显示弱或无带，但可通过抗CXCR4检测到（a、左侧和b、右侧的下部面板）。
图3
图3
单核细胞内内源性CXCR4/CD74受体复合物的形成。从MonoMac6细胞裂解物中共免疫沉淀内源性CD74/CXCR4复合物。（a） 流式细胞术直方图显示MonoMac6中CXCR4的丰富表面表达。比较抗CXCR4染色细胞（绿色）和FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。（b） 流式细胞术分析与抗CD74染色相同（红色）。（c） 共免疫沉淀显示内源性CXCR4/CD74复合物的形成。对MonoMac6裂解产物进行抗CD74免疫沉淀，并使用抗CXCR4蛋白印迹检测复合CXCR4。（d） 为CD74开发的对照印迹。仅用珠子进行对照免疫沉淀（对照）；输入通道表明对5%的MonoMac6裂解物进行了Western blot分析。分子量标准品在同一凝胶（Mr）中电泳。免疫沉淀；WB、Western blot。表明次级WB抗体对免疫球蛋白重链（IgG-HC）和轻链（Ig G-LC）进行了非特异性染色。*表明除了40 kDa的主要CXCR4带外，还检测到了第二个特异带，这可能代表不同糖基化的CXCR4变体（47 kDa）。
图4
图4
CXCR4/CD74受体复合物的形成与CD74和CXCR4之间的功能相互作用有关。CXCR4抑制剂AMD3100以及抗CXCR4和抗CD74抗体阻断了Jurkat T细胞中MIF介导的AKT激活，而SDF-1α介导的AKT激活仅被抗CXCR4+而非抗CD74降低。（a） 流式细胞术直方图显示Jurkat T细胞中CXCR4的表面表达。对比抗CXCR4染色细胞（绿色）和非特异性FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。（b） 流式细胞术直方图显示Jurkat T细胞中CD74的表面表达。比较抗CD74染色细胞（红色）和非特异性FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。（c） 用AMD3100（1μg/ml，30 min；+AMD3100+）或对照缓冲液预处理的Jurkat细胞与指定浓度的rMIF孵育10 min，并使用磷酸化-Ser473-AKT抗体通过Western blot测定AKT活化。肌动蛋白染色用于印迹的标准化。（d） 根据（c）（磷酸化比率：AKT/actin；平均值n个= 2). （e） 与c组相同，但Jurkat细胞用抗CD74、抗CXCR4抗体或对照IgG1预处理（每个10μg/ml，30分钟）。以100 ng/ml的浓度添加MIF，并用100 ng/ml SDF-1α刺激对照细胞。（f） 根据（e）（磷酸化比率：AKT/actin；平均值n个= 2).
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