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.2009年9月18日；325(5947):1555-9.
doi:10.1126/science.1174229。 Epub 2009年8月6日。

葡萄糖剥夺对肿瘤细胞KRAS通路突变的影响

Jihye Yun先生 1, 卡洛·拉戈, 伊恩·张, 雷·帕利亚里尼, 菲利普·安杰南特, 哈里斯·拉贾戈帕兰, 科尔斯汀·施密特, 詹姆斯·K·V·威尔森, 桑迪·马科维茨, 周士斌, 路易斯·迪亚兹（Luis A Diaz Jr）, 维克托·维库列斯库, 克里斯托夫·伦高尔, 肯尼思·金兹勒, 贝尔特·福格尔斯泰因, 尼克拉斯·帕帕佐普洛斯
附属公司

葡萄糖剥夺对肿瘤细胞KRAS通路突变的影响

Jihye Yun先生等。 科学类. .

摘要

肿瘤进展是由基因突变驱动的，但对选择这些突变的环境条件知之甚少。通过研究仅在KRAS或BRAF基因突变状态上不同的成对结直肠癌细胞系的转录组，我们发现编码葡萄糖转运蛋白-1的GLUT1是KRAS或BRAF突变细胞中持续上调的三个基因之一。突变细胞表现出葡萄糖摄取和糖酵解增强，并在低血糖条件下存活，这些表型都需要GLUT1表达。相反，当具有野生型KRAS等位基因的细胞受到低葡萄糖环境时，很少有细胞存活。大多数存活细胞表达高水平的GLUT1，其中4%的存活细胞获得了父母中不存在的KRAS突变。糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸优先抑制KRAS或BRAF突变细胞的生长。总之，这些数据表明，葡萄糖缺乏可以驱动人类肿瘤中KRAS通路突变的获得。

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数字

图1
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的表达式GLUT1公司在配对的等基因克隆中。(一)的表达式级别GLUT1公司通过实时PCR测定转录物，并将其归一化为β-肌动蛋白的转录物。每个面板都包括亲本系（Parent），其中包含突变和野生型等位基因KRAS公司或BRAF公司，两个仅含突变等位基因的独立克隆（MUT1和MUT2）和两个仅含有野生型等位基因（WT1和WT2）的独立克隆。数据表示三次试验的平均值和SD。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.05，学生t检验）。(B类)通过免疫印迹法测定GLUT1膜相关蛋白水平的表达。纳+，K+-ATP酶是一种膜相关蛋白，用作负荷控制。
图1
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的表达式GLUT1公司在配对的等基因克隆中。(一)的表达式级别GLUT1公司通过实时PCR测定转录物，并将其归一化为β-肌动蛋白的转录物。每个面板都包括亲本系（Parent），其中包含突变和野生型等位基因KRAS公司或BRAF公司，两个仅含突变等位基因的独立克隆（MUT1和MUT2）和两个仅含有野生型等位基因（WT1和WT2）的独立克隆。数据表示三次试验的平均值和SD。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.05，学生t检验）。(B类)通过免疫印迹法测定GLUT1膜相关蛋白水平的表达。纳+，K+-ATP酶是一种膜相关蛋白，用作负荷控制。
图2
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葡萄糖摄取和乳酸生成KRAS公司或BRAF公司突变。(一)葡萄糖摄取，使用[三H] 2-脱氧葡萄糖，归一化为总蛋白。MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.01，学生t检验）。(B类)乳酸产量根据细胞数量进行标准化。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.03，学生t检验）。数据表示三次试验的平均值和SD。
图2
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葡萄糖摄取和乳酸生成KRAS公司或BRAF公司突变。(一)葡萄糖摄取量，使用[三H] 2-脱氧葡萄糖，归一化为总蛋白。MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.01，学生t检验）。(B类)乳酸产量根据细胞数量进行标准化。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.03，学生t检验）。数据表示三次试验的平均值和SD。
图2
图2
葡萄糖摄取和乳酸生成KRAS公司或BRAF公司突变。(一)葡萄糖摄取量，使用[三H] 2-脱氧葡萄糖，归一化为总蛋白。MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.01，学生t检验）。(B类)乳酸产量根据细胞数量进行标准化。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.03，学生t检验）。数据代表了一式三份实验的平均值和标准差。
图3
图3
KRAS公司和BRAF公司突变在低血糖条件下具有选择性生长优势。(一)将细胞置于低葡萄糖环境（0.5mM）中两天（RKO和VACO432）或四天（HCT116和DLD1），然后解离并接种在含有标准浓度葡萄糖（25mM）的培养基中。菌落计数标准化为在接受相同实验程序的细胞中获得的菌落计数，但标准葡萄糖水平被替换为低血糖。详见（7）。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.004，学生t检验）。(B类)MUT和WT克隆以指定的比例混合，并在含有0.5 mM葡萄糖的培养基中生长两天（RKO）或五天（DLD1）。将培养基替换为含有25 mM葡萄糖的培养基，并将细胞再培养10–16天。从存活的细胞中纯化RNAKRAS公司或BRAF公司对基因进行PCR扩增和测序。序列色谱图中下划线位置的G和A核苷酸代表的wt和突变等位基因KRAS公司分别在DLD1细胞中。T和A核苷酸代表的wt和突变等位基因BRAF公司分别在RKO细胞中。(C类)DLD1细胞中突变体KRAS公司等位基因被靶向重组删除(KRAS公司（−/+）），在低葡萄糖（0.5 mM）中进行电镀。25-30天后，存活下来的少数克隆在标准葡萄糖（25 mM）中生长，并评估GLUT1表达和KRAS公司基因。含有突变等位基因的克隆KRAS公司（G12D、G13D或G13C），以及其中的克隆KRAS公司保持WT。作为对照，相同的细胞(KRAS公司（−/+））在含有25 mM葡萄糖的培养基中进行极限稀释，并对单个克隆进行GLUT1表达评估（“对照克隆”）。还包括用于这些实验的亲本细胞（DLD1，WT），以及它们的等基因对应物，其中WT而非突变等位基因被同源重组（DLD1，MUT）破坏。当收获用于通过免疫印迹法评估GLUT1表达时，所有克隆均在含有25 mM葡萄糖的培养基中生长至少20天。纳+，K+-ATP酶被用作负荷控制。图S10中提供了选择方案的示意图，（7）中提供了详细的方法。
图3
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KRAS公司和BRAF公司突变在低血糖条件下具有选择性生长优势。(一)将细胞置于低葡萄糖环境（0.5 mM）中2天（RKO和VACO432）或4天（HCT116和DLD1），然后分离并置于含有标准葡萄糖浓度（25 mM）的培养基中。菌落计数标准化为在接受相同实验程序的细胞中获得的菌落计数，但标准葡萄糖水平被替换为低血糖。详见（7）。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.004，学生t检验）。(B类)MUT和WT克隆以指定的比例混合，并在含有0.5 mM葡萄糖的培养基中生长两天（RKO）或五天（DLD1）。将培养基替换为含有25 mM葡萄糖的培养基，并将细胞再培养10–16天。从存活的细胞中纯化RNAKRAS公司或BRAF公司对基因进行PCR扩增和测序。测序色谱图中下划线位置的G和A核苷酸代表KRAS公司分别在DLD1细胞中。T和A核苷酸代表的wt和突变等位基因BRAF公司分别在RKO细胞中。(C类)DLD1细胞中突变体KRAS公司等位基因被靶向重组删除(KRAS公司（−/+）），在低葡萄糖（0.5 mM）中进行电镀。25-30天后，存活下来的少数克隆在标准葡萄糖（25 mM）中生长，并评估GLUT1表达和KRAS公司基因。含有突变等位基因的克隆KRAS公司（G12D、G13D或G13C），以及其中的克隆KRAS公司保持WT。作为对照，相同的细胞(KRAS公司（−/+））在含有25 mM葡萄糖的培养基中进行极限稀释，并对单个克隆进行GLUT1表达评估（“对照克隆”）。还包括用于这些实验的亲本细胞（DLD1，WT），以及它们的等基因对应物，其中WT而非突变等位基因被同源重组（DLD1，MUT）破坏。当收获用于通过免疫印迹法评估GLUT1表达时，所有克隆均在含有25 mM葡萄糖的培养基中生长至少20天。纳+，K+-ATP酶作为负载对照。图S10中提供了选择方案的示意图，（7）中提供了详细的方法。
图4
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糖酵解抑制剂3-BrPA对突变细胞具有选择性毒性KRAS公司或BRAF公司等位基因。(一)3-BrPA治疗（110μM）三天后评估菌落形成。将菌落计数归一化为从未接触3-BrPA的细胞中获得的菌落计数。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.008，学生t检验）。(B类)HCT116皮下肿瘤小鼠(KRAS公司：G13D/+）或VACO432(BRAF公司：V600E/+）细胞每天腹腔注射3-BrPA或磷酸盐缓冲液（PBS），持续两周。“n”表示每组使用的小鼠数量。点和误差条代表每组小鼠的平均值和SD。星号表示PBS组与3-BrPA组肿瘤大小存在显著差异的时间(P（P）<0.05，学生t检验）。
图4
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糖酵解抑制剂3-BrPA对突变细胞具有选择性毒性KRAS公司或BRAF公司等位基因。(一)3-BrPA治疗（110μM）三天后评估菌落形成。将集落计数标准化为从经过相同程序而未暴露于3-BrPA的细胞中获得的集落计数。在所有病例中，MUT和WT克隆之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.008，学生t检验）。(B类)HCT116皮下肿瘤小鼠(KRAS公司：G13D/+）或VACO432(BRAF公司：V600E/+）细胞每天腹腔注射3-BrPA或磷酸盐缓冲液（PBS），持续两周。“n”表示每组使用的小鼠数量。点和误差条代表每组小鼠的平均值和SD。星号表示PBS组与3-BrPA组肿瘤大小存在显著差异的时间(P（P）<0.05，学生t检验）。
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