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.2009年8月15日；69(16):6414-22.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-1223。 Epub 2009年8月4日。

脯氨酸氧化酶在人类癌症中作为线粒体肿瘤抑制剂的作用

刘永民 1, 格雷戈里·博彻特, 史蒂文·唐纳德, Bhalchandra A Diwan公司, 米丽亚姆·安弗, 詹姆斯·M·彭
附属公司

脯氨酸氧化酶在人类癌症中作为线粒体肿瘤抑制剂的作用

刘永民等。 癌症研究. .

摘要

肿瘤代谢和生物能量学已成为癌症研究的重要课题，是抗癌治疗的重要靶点。虽然葡萄糖是主要的能量来源，但脯氨酸，一种替代底物，非常重要，特别是在营养胁迫期间。脯氨酸氧化酶（POX）催化脯氨酸分解代谢的第一步，由p53诱导，可以调节细胞存活并介导程序性细胞死亡。在小鼠异种移植物肿瘤模型中，我们发现POX通过引起G2细胞周期停滞而大大减少了肿瘤的形成。此外，免疫组织化学染色显示肿瘤组织中POX表达降低。重要的是，由于α-酮戊二酸（脯氨酰羟基化和HIF-1α降解的关键底物）的生成增加，HIF-1 alpha信号随着POX表达而受损。结合先前的体外研究结果和报道的临床遗传相关性，这些新发现使我们提出POX是一种线粒体肿瘤抑制剂和癌症治疗的潜在靶点。

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图1
图1
体内肿瘤生长抑制。将DLD-1 Tet-off POX细胞和载体对照细胞注射到Balb/C裸鼠体内。（A） ●●●●。注射细胞后，给小鼠饮用含或不含DOX的水时，发生肿瘤的小鼠数量。左侧面板显示小鼠注射POX细胞；右侧面板显示小鼠注射了载体细胞。对于那些注射了POX细胞的DOX组小鼠，其中一半（8只）的小鼠被切换为注射DOX水。记录小鼠发生肿瘤的数量。H&E染色和POX免疫组织化学染色显示POX的诱导表达和位置。（B） TUNEL分析显示POX表达细胞具有较高的凋亡诱导作用。右侧面板显示至少3张幻灯片的定量。显示平均值±SD。（C） ●●●●。免疫组织化学染色显示POX减少BrdU掺入。右侧面板显示至少3张幻灯片中的量化。显示平均值±SD。（D） ●●●●。软琼脂试验显示POX降低了DLD-1细胞的克隆能力。右侧面板是每孔克隆的定量，表示至少4次测定的数据±。星号表示有统计学意义的差异（*p<0.05，**p<0.01）。C-E的放大倍数为×40或×100。
图2
图2
POX引起的G2细胞周期阻滞。（A） ●●●●。通过增加DLD-1-Tet-Off POX细胞中的DOX浓度，POX受到剂量依赖性抑制。细胞生长试验表明，增加DOX浓度可使DLD-1细胞从POX介导的生长抑制中释放出来。（B） ●●●●。流式细胞术分析表明，随着DOX浓度的降低，POX表达增加，G2细胞周期阻滞。（C） ●●●●。Western blot显示，随着DOX的降低，POX的表达增加，Geminin被诱导。（D） ●●●●。随着DOX浓度的降低，POX表达对G的几种重要调节因子的影响2通过Western blots测定相。
图3
图3
GADD家族蛋白的参与。DLD-1 Tet-off POX细胞在含有20 ng/ml[（+）DOX]或100和1000稀释液（0.2 ng/ml，0.02 ng/ml）的培养基中培养1或3天。收获细胞，制备RNA和细胞裂解物，然后对GADD成员进行半定量RT-PCR（A&B）和蛋白质印迹（C）。肌动蛋白作为对照。
图4
图4
POX在人类肿瘤组织中的表达降低。对92对同一患者的癌组织和正常组织进行了POX免疫组化染色，其中36对来自胃肠系统，6对来自肾脏。（A） ●●●●。结肠、胃、肝脏、胰腺和肾脏组织的代表性图像。放大倍数，×100。（B） ●●●●。采用Z检验进行统计分析（减少比例的零假设等于50%）。DT：消化道组织。
图5
图5
POX对HIF信号传导和TCA循环中间体的影响。（A） ●●●●。Western blots显示，在常氧和缺氧条件下（氧浓度为1%），HIF-1α及其下游基因VEGF受到抑制2). 还显示了四个Western blot在常氧条件下对HIF-1α的相对平均密度测定数据（B）。为了确定ROS/超氧化物对HIF信号传导的影响，通过腺病毒载体引入MnSOD，该载体不会逆转POX对HIF-1α表达的影响。（C） ●●●●。DLD-POX细胞镀上强力霉素。18小时后，用含或不含多西环素的新鲜培养基代替电镀培养基。采用高压液相色谱法测定α-KG的含量。用GC/MS测定琥珀酸、富马酸和乳酸的水平。数据表示为nmol/106并表示至少3次测定的平均值±SD。（D） 通过Western blots证实DMOG对HIF-1α水平的影响。星号表示存在统计显著差异(**对< 0.01. HIF-1α*表示接触时间更长）。
图6
图6
POX抑制HIF信号传导的拟议机制。脯氨酸和P5C之间的相互转化，分别由POX和P5CR催化，形成脯氨酸循环。当POX高表达时，P5C、谷氨酸和α-KG相继产生，在脯氨酸和TCA循环之间形成重要联系。作为脯氨酰羟化酶的重要底物，α-KG增加HIF-1α的羟基化，HIF-1将通过泛素和蛋白质体降解系统降解。这可能是POX表达减少HIF信号的主要机制。另一方面，TCA循环受到影响，富马酸盐、琥珀酸盐和乳酸盐的细胞水平降低就是明证。这些TCA循环中间产物水平的降低也可能有助于削弱HIF信号。事实上，抑制HIF可能是POX发挥其抑瘤作用的另一种机制，这与之前确定的机制一样。
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