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.2009年8月28日；325(5944):1139-42.
doi:10.1126/science.1175689。 Epub 2009年7月23日。

琥珀酸脱氢酶黄变所需的基因SDH5在副神经节瘤中突变

怀祥浩 1, Oleh Khalimonchuk, 马吉特·施拉德斯, 诺亚·德普霍尔, Jean-Pierre Bayley女士, 亨利库斯特, 彼得·德维利, Cor W R J Cremers公司, 约书亚·D·希夫曼, 布兰登·G·本茨, 史蒂文·普·吉吉, 丹尼斯·R·温格, 汉尼·克莱默, 贾里德·拉特
附属公司

琥珀酸脱氢酶黄变所需的基因SDH5在副神经节瘤中突变

怀祥浩等。 科学类. .

摘要

哺乳动物线粒体含有约1100种蛋白质，其中近300种没有特征。鉴于线粒体缺陷在人类疾病中的既定作用，这些蛋白质的功能特征可能为疾病机制提供新的线索。从酵母作为模型系统开始，我们研究了一种无特征但高度保守的线粒体蛋白（此处命名为Sdh5）。酵母和人类Sdh5都与琥珀酸脱氢酶（SDH）复合物的催化亚单位相互作用，SDH是电子传递链和三羧酸循环的组成部分。Sdh5是SDH依赖性呼吸和Sdh1黄素化（黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子的掺入）所必需的。位于染色体11q13.1上的人类SDH5基因的种系丧失功能突变与遗传性副神经节瘤家族的疾病分离，该家族是一种神经内分泌肿瘤，以前与编码SDH亚单位的基因突变有关。因此，通过对酵母中的线粒体蛋白质组进行分析，发现了人类肿瘤易感基因。

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数字

图1
图1
Sdh5是呼吸所必需的，并与Sdh1相互作用。(A类)用（+）或不用（−）蛋白酶K处理线粒体、由低渗肿胀产生的线粒体和来自表达Sdh5 HA的菌株的1%Triton X-100溶解的线粒体，并用未处理的线粒体对照（UT）通过免疫印迹进行分析。Mge1、Tim10和Fzo1分别是基质蛋白、膜间隙蛋白和外膜蛋白。(B类)免疫印迹法检测纯化线粒体（4）的可溶性部分和膜部分，如（A）所示。Aco1，可溶性基质蛋白；膜相关基质蛋白。(C类)连续稀释WT和瑞士法郎5在葡萄糖或甘油培养基上发现含有空载体（EV）或表达Sdh5-HA的质粒的Δ菌株，并分别在30℃下培养2或3天。(D类)WT中的耗氧量，瑞士法郎5Δ，以及sdh1型Δ菌株在棉籽糖培养基中生长到中对数期（±SD，n个=3个生物复制品）。在葡萄糖培养基中也得到了类似的结果。(E类)串联纯化从WT菌株和表达Sdh5-His的菌株中洗脱（4）6/HA用SDS-PAGE溶解，并通过银染色（顶面板）或用Sdh1和HA抗体的免疫印迹（下面板）进行可视化。(F类)纯化WT线粒体的免疫印迹，sdh1型Δ，或sdh2Δ表达Sdh5-HA的菌株。孔蛋白，线粒体负荷控制。
图2
图2
SDH活性和稳定性需要Sdh5。(A类)来自WT和瑞士法郎5Δ线粒体，归一化为总蛋白（±SD，n个=3个生物复制品）。(B类)WT和WT线粒体膜BN-PAGE后ETC复合物的In-gel活性测定瑞士法郎5Δ应变。V（V）2，复合V二聚体。(C类)来自WT和瑞士法郎5Δ应变。(D类)使用Myc抗体对BN-PAGE分离的复合物II/SDH进行免疫印迹，以在WT和瑞士法郎5Δ线粒体(E类)使用TAP抗体对BN-PAGE分离的WT和Sdh5-TAP线粒体进行免疫印迹，无需和有1%SDS预处理。波林是一种~440-kD的对照物。(F类)WT和WT线粒体的免疫印迹瑞士法郎5Δ菌株，其中Sdh3或Sdh4被Myc-tagged，分离为可溶性（sol）和膜（mem）部分（4），或未分离（总计）。Aco1，可溶性基质蛋白。所示百分比为剩余金额sdh5型Δ线粒体相对于WT线粒体。
图3
图3
Sdh5对Sdh1黄变是必要和充分的。(A类)重量，sdh5型Δ和sdh1型Δ线粒体通过SDS-PAGE进行解析，并成像（4）共价FAD（顶面板）或免疫印迹（下面板）。(B类)荧光凝胶图像（顶面板）和免疫印迹（下面板），如（A）所示，含WT或flx1型Δ瑞士法郎5Δ含有EV、CEN质粒的菌株SDH5型(flx1Δ：每个细胞约1个拷贝），或2μ质粒SDH5型（O/E:~10个副本/单元）。条形图显示标准化FAD荧光（±SD，n个=3个生物复制品）（底部面板）。(C类)His-tagged酵母Sdh1单独或与Sdh5或Sdh2在大肠杆菌，纯化并分析FAD荧光，如（A）和考马斯蓝染色。
图4
图4
一个人SDH5型PGL2功能丧失突变。(A类)杂合c.232G>A突变与PGL2谱系中的疾病分离（17）。黑色符号、受影响人员；白色符号，未受影响的人；+，杂合突变；NT，未测试。带数字4的钻石代表四个未受影响的个体。因母体11号染色体上携带突变而未受影响的个体标记为m。出于隐私原因，一名健康母体突变携带者和五名未受影响父体突变携带者未出现在系谱中。(B类)人类肿瘤、细胞系和小鼠组织样本的荧光凝胶图像（顶面板）和免疫印迹（下面板）。车道1和2，散发性PGL肿瘤；3至5道，PGL2肿瘤（hSDH5 G78R）；第6和第7车道、HEK293和HepG2人类细胞系；泳道8和9、正常小鼠骨骼肌（skM）和肝脏。(C类)将含有EV或表达WT或G78R hSDH5-Myc的HEK293细胞的裂解液用与Myc抗体结合的琼脂糖珠免疫沉淀。对裂解液、洗脱液和未结合部分进行FAD成像（顶部面板）和免疫印迹（下部三个面板）。(D类)连续稀释WT和瑞士法郎5在葡萄糖或甘油培养基上发现含有EV或表达酵母Sdh5-Myc、WT人Sdh5-Myc或G78R hSDH5-Myc质粒的Δ菌株，并分别在30℃下培养2或3天。(E类)荧光凝胶图像（顶面板）和（D）中五种菌株的全细胞提取物的免疫印迹（下面板）。PGK，加载控制。FAD荧光标准化为Sdh1蛋白水平，并表示为相对于WT的百分比（Flavo%，±SD，n个=3个生物复制品）。
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    1. Lin MT，Beal MF.自然。2006;443:787.-公共医学
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