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.2009年10月；126(10):898-912.
doi:10.1016/j.mod.2009.07.002。 Epub 2009年7月10日。

Notch反应细胞启动斑马鱼幼体胰腺的二次转变

迈克尔·帕森斯 1, Harshan Pisharath公司, 沙米拉·优素福, 约翰·C·摩尔, 阿恩特·F·西克曼, 内森·劳森, 史蒂文·德利奇
附属公司

Notch反应细胞启动斑马鱼幼体胰腺的二次转变

迈克尔·J·帕森斯等人。 机械开发. 2009年10月.

摘要

斑马鱼为研究脊椎动物的发育提供了一个高度通用的模型。许多最近的研究阐明了斑马鱼胰腺器官发生的早期事件；然而，斑马鱼早期内分泌胰腺形成的几个方面与哺乳动物系统并不同源。为了更好地确定斑马鱼胰岛形成的机制，并与哺乳动物中观察到的胰岛形成机制具有真正的同源性，我们对斑马鱼次级胰岛形成进行了时间和空间表征。与小鼠的情况一样，我们表明Notch抑制导致内分泌组织的早熟分化。此外，我们使用表达荧光标记的转基因鱼，在Notch反应元件的控制下，观察这些诱导内分泌细胞的前体。这些胰腺Notch反应细胞代表了与幼体胰腺导管上皮相关的新的假定祖细胞群，表明斑马鱼次级胰岛形成与哺乳动物次级过渡之间的功能同源性。我们还发现，Notch反应细胞存在于成人胰腺中，并具有着丝粒细胞的典型特征，这种细胞类型被认为是成年哺乳动物胰腺中的多能干祖细胞。

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数字

图1
图1
次级胰岛在幼虫出生后的前3周内形成，与主胰管相连。（A） 随着时间的推移，二级胰岛的计数结果Tg（P0-pax6:GFP）ulg515年或Tg（单位：mCherry）jh2型幼虫。从第5天开始，很少有幼虫表现出转基因检测到的次级胰岛。到20天时，几乎所有幼虫都至少有一个次级胰岛。（B） 28dpf胰腺石蜡切片，Tg（ptf1a:eGFP）jh1号机组免疫荧光检测GFP（绿色）和胰岛素（红色）后的青少年。主胰管可以区分为穿过胰尾中部的GFP阴性细胞条。胰腺尾部（↑）可见两个次级胰岛，与导管密切相关。插图是左侧次级胰岛的放大图。在导管上可以看到一个孤立的β细胞（◄）。（C）成人胰腺叶的冷冻切片Tg（ins:nfsB-mCherry）jh5公司;Tg（P0-pax6b:GFP）ulg515年包括主胰岛（大箭头）和两个重要的次级胰岛（↑）。（D，E，F）次级胰岛特写（左二）；（D） 亮视野图像与细胞核染色相结合，显示出一个形态上皮管（由白色虚线勾勒）。（E） β细胞可通过红色荧光识别，位于导管分支的紧密结合处。（F）Pax6b型表达细胞标记为绿色，合并后的图像显示内分泌细胞靠近导管。（D、E、F比例尺=20μm）
图2
图2
转基因斑马鱼可以报告Notch-signaling活动。Notch响应元件用于产生两个转基因株系Tg（Tp1bglob:eGFP）第13个月和Tg（Tp1bglob:hmgb1-mCherry）jh11号机组两个品系的杂交纯合动物在所有个体中都有表达荧光标记的离合器。每条线路的代表（24hpf）如（A）和（G）所示。将离合器配合物与Notch-signaling抑制剂DAPT（100μM）从80%表观培养至24hpf，导致荧光蛋白（B和H）减少。这表明抑制Notch-signaling同时降低Tp1转基因活性。NICD在我们的红色Notch反应系中的过度表达是使用Gal4/UAS二分系统进行的（Scheer和Campos-Ortega，1999）。（C-E）以下结构的示意图：（C）Tp1bglob:hmgb1-m樱桃，（D）无人机系统：notch1a内部和（E）hsp70l：镀锌4在所有三种结构存在的情况下，在热休克后，转录激活物Gal4通过其上游激活位点（UAS）（虚线箭头，E）表达并转录激活，这指导NICD的表达。这种外源性NICD增强了内源性NICD（虚线箭头，D），并与RBP-Jκ和辅助因子协同增加了Tp1元件的活性。（F） 来自Tg（Tp1bglob:hmgb1-mCherry；UAS:notch1a-intra；hsp70l:Gal4）×Tg（UAS:notch1a-intra)选择杂交后代进行红色荧光处理，然后进行热激处理或保存作为对照。6小时后，对胚胎进行红色荧光评分，红色荧光增强程度高于对照组。然后对所有胚胎进行基因型分析，以确定是否存在hsp70l:Gal4（hsp）和无人机：notch1a-intra（UAS）转基因。如（F）和（I-L）所示的例子所示，增强的红色荧光依赖于热休克和Gal4和UAS转基因的拥有（插图显示基因分型，UAS/？指UAS/UAS或UAS/+）。总之，这些结果表明NICD的过度表达增加了Tp1元件的表达。用于记录荧光图像的曝光时间在A和B、G和H以及I-L中是恒定的。
图3
图3
胰腺Notch反应细胞在5dpf公司斑马鱼胰腺的共焦显微镜成像。（A、B、D、E、G、H、J、K）低倍图像，以查看整个发育器官，在（A）中勾勒出（白点）（比例尺=50μM）。（D，G，J）亮场合并图像可显示胰腺方向，使胰腺位于肠球顶部（白色*），主胰岛（白色→）和胰头位于左侧，胰尾位于右侧。（C，F，I，L）高倍显示详细的细胞结构（比例尺=10μM）。显微胰腺的（A-F）图像Tg（Tp1bglob:eGFP）第13个月幼虫；由于细胞质GFP，PNC可视为绿色。GFP阳性的PNC可以通过胰腺（A）检测出来，免疫荧光染色检测E-钙粘蛋白（红色）表明绝大多数PNC是上皮性的（B，C）。在较高的磁场（C）下，也可以看到E-cad阴性的Notch反应细胞（►◄）。这些细胞代表早期胰腺动脉血供的内皮细胞。（D-F）Tg（ptf1a:Gal4VP16）jh16号机组;Tg（T2KUAS:nfsB-mCherry）jh17号机组幼虫在发育中的外分泌胰腺中以镶嵌方式表达红色荧光。的域ptf1a型驱动红色荧光不包括PNC。显微胰腺的（G-L）图像Tg（T2KTp1bglob:hmgb1-mCherry）jh11型，幼虫；PNC中的细胞核可以用红色显示Tg（-3.5kbnkx2.2:GFP）国际原子能机构3幼虫在先前报道的一种细胞类型中表达绿色荧光，称为胰腺导管。（一） 一些但不是所有表达GFP的细胞也对Notch活性作出反应。（J-L）Tg（kdrlG-RCFP）锌1在脉管系统中表达绿色荧光的幼虫。除了（C）中所示的同一动脉外，所有内皮细胞均为Notch非反应性。
图4
图4
抑制Notch-signaling显著诱导早熟继发性胰岛形成。（A-E）5dpf显微胰腺的共焦图像。（A）Tg（Tp1bglob:hmgb1-mCherry）jh11号机组; Tg（P0-pax6b:GFP）ulg515年未经处理的幼虫展示pax6b型表达细胞（绿色）仅定位于主胰岛（◄），PNC（红色）位于胰岛周围并穿过胰尾中部。（B，C）相同的复合转基因幼虫，当用100μM DAPT从3dpf到5dpf处理时，显示PNC急剧丢失，同时胰腺尾部出现Pax6b内分泌细胞。（B） 表示典型结果，（C）表示极端示例。（D）Tg（T2基因：mCherry）j个氢气;Tg（gcga:GFP）国际原子能机构1幼虫的主要胰岛含有β细胞（红色），周围有α细胞（绿色）。（E） DAPT治疗导致胰腺尾部出现大量α-细胞和少量β-细胞（→）。（F） 标记早期泛内分泌细胞的转基因株幼虫[Tg（P0-pax6b:eGFP）ulg515年]，α-细胞[Tg（gcga:GFP）国际原子能机构1]和β细胞[Tg（T2Kins:mCherry）jh2公司]在三个时间点检查次级胰岛的数量。通过100μM DAPT治疗，观察到明显更多的次级胰岛。在治疗组或未治疗组中pax6b型在早期发育阶段观察到表达胰岛，而不是其他标志物。β细胞标记物是观察到的最不常见的。
图5
图5
10dpf幼虫胰腺横切面的电镜照片。（A） 低倍镜下，胰腺的整个横切面呈三角形。胰腺外分泌部腺泡细胞的特征是细胞核大和酶原颗粒大。在胰腺的正中央可以看到胰管的管腔（{，标尺=10μm）。（B）（A）中管腔区域的特写。管腔周围可以看到三个细胞（标尺=1μm）（C）这些导管局限性细胞向管腔内投射。只要这些细胞的细胞膜彼此直接接触，就会观察到明显的紧密连接（►，标尺=500nm）。（D） 利用金结合次级免疫电子显微镜检测胰腺中GFP蛋白Tg（Tp1bglob:eGFP）第13个月幼虫（比例尺=500nm）。由于固定方式的改变，超微结构似乎略有不同，以允许免疫标记。金颗粒看起来非常暗且呈圆形（见插图放大），并且在导管内的整个细胞中都能检测到。这些细胞形态相似，位置与EM之前观察到的细胞相同。这表明前面描述的PNC位于胰管内壁。
图6
图6
斑马鱼成年胰腺的中心腺泡细胞具有缺口反应性。（A） 成年斑马鱼胰腺的H&E染色切片显示，其组织学与哺乳动物胰腺非常相似。（B-C）Tg成人胰腺的共焦图像(ptf1a:eGFP)jh1号机组;Tg（Tp1bglob:hmgb1-mCherry）jh11号机组鱼。腺泡细胞很容易通过ptf1a型转基因表达（绿色）。PNC的细胞核以红色荧光标记。（C） 单个腺泡的高磁像。由于GFP被排除在外，顶端定位的酶原颗粒（白色箭头）显示为黑圈。腺泡细胞顶面围绕PNC的三个红色细胞核。由于其在成人胰腺中的位置和Notch反应性，这些细胞是明确的中央腺泡细胞（比例尺=10μm）。（D-F）成人图像Tg（Tp1bglob:eGFP）第13个月胰腺。（D，E）纵向冷冻切片胰腺（标尺=20μm）上GFP（绿色）和羧肽酶A（CPA，红色）免疫荧光检测的共焦图像。（F） 通过腺泡切片的GFP免疫金检测Tg（Tp1bglob:eGFP）第13个月成人胰腺。EM清楚显示两个中心腺泡细胞，细胞核不规则，被腺泡细胞包围（特征是存在酶原颗粒►）。金颗粒定位于中心腺泡的细胞（见右插图放大以查看金颗粒），而不是腺泡细胞（见左插图）。比例尺=2μm）（B、C、D、E）细胞核被Hoechst染成蓝色。
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