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。2009年8月6日；460（7256）：705-10。
doi:10.1038/nature08195。 Epub 2009年7月5日。

miR-145和miR-143调节平滑肌细胞的命运和可塑性

Kimberly R Cordes公司 1, 尼尔·T·希伊, Mark P白色, 艾米丽·贝瑞, 莎拉·U·莫顿, Alecia N Muth（阿莱西亚·穆特）, 李廷海因, 约瑟夫·米亚诺, 凯瑟琳·N·艾维, 塔瓦
附属机构

miR-145和miR-143调节平滑肌细胞的命运和可塑性

Kimberly R Cordes公司等。 自然。 。

摘要

微RNA（miRNAs）是无数细胞事件的调节器，但关于单个miRNA能够有效地将多能干细胞分化为特定谱系或调节细胞直接重编程为替代细胞命运的证据尚不明确。在这里，我们发现miR-145和miR-143在多潜能小鼠心脏祖细胞中共同转录，然后定位于平滑肌细胞，包括神经嵴干细胞衍生的血管平滑肌细胞。miR-145和miR-143是血清反应因子、心肌蛋白和Nkx2-5（NK2转录因子相关，基因座5）的直接转录靶点，在含有增殖性、低分化平滑肌细胞的损伤或动脉粥样硬化血管中下调。miR-145对于肌钙蛋白诱导成年成纤维细胞重编程为平滑肌细胞是必需的，并且足以诱导多能干细胞分化为血管平滑肌。此外，miR-145和miR-143协同靶向转录因子网络，包括Klf4（Kruppel-like factor 4）、mycardin和Elk-1（ELK1，ETS癌基因家族成员），以促进平滑肌细胞的分化和抑制增殖。这些发现表明，miR-145可以指导平滑肌的命运，miR-141和miR-143具有调节平滑肌细胞静止与增殖表型的功能。

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数字

图1
图1。miR-143和miR-145是心脏和平滑肌特异性miRNA
(a–c)在指定的时间点，使用4.2 kb增强子-lacZ构建物（补充图2a）的转基因小鼠胚胎中显示心肌特异性β-半乳糖活性的整体支架。(d日)的横截面(c（c）)β-gal在咽中胚层（pm）、咽内胚层（pe）、背主动脉（da）、心肌（mc）、心内膜（ec）均有表达。(e、 （f）)β-gal在胚胎期的表达（E）15.5(e（电子）)或产后（第21页）(（f）)心脏。主动脉；pa，肺动脉。(g、 小时)的横截面(（f）); co，冠状动脉。(i、 j个)P21心脏切片miR-145原位杂交。(小时)和(j个)表示方框区域的放大倍数更高。（pcm，心前中胚层；ht，心脏；h，头部；ot，流出道；rv，右心室；lv，左心室；cv，主静脉；ra，右心房；la，左心房）。
图2
图2。SRF和Nkx2.5直接调节心肌和平滑肌miR-143和miR-145的表达
(a–e)横向(a、 b、c、e)或正面(d日)含有指示lacZ结构的转基因胚胎的心脏视图，并对β-Gal活性进行染色。(（f）)通过在Cos细胞中引入带有miR-143/145增强子的SRF、Myocd或Nkx2.5表达载体指导荧光素酶活性的折叠激活。所有变化均具有统计学意义（n=5）。(克)miR-143和miR-145的表达水平通过qPCR第10天所示基因型的甜味剂小体（EBs）评估。(小时)miR-143和miR-145的qPCR牛顿x2.5+/−和牛顿x2.5−/−E9.5心脏相对于体重(i、 j个)损伤血管中miRNA的qPCR(我)或动脉粥样硬化病变(j个)与正常动脉表达相比。结果如所示(（f）–j个)是三个实验的平均值。（ot，流出道；ra，右心房；lv，左心室；rv，右心室；la，左心房；背主动脉）。*，p<0.05。误差条指示SD。
图3
图3。miR-145指导血管平滑肌细胞的命运
(一)在规定条件下，使用平滑肌（Sm）α-肌动蛋白抗体（红色）对10T1/2成纤维细胞进行免疫细胞化学；核染色，Dapi（蓝色）。(b条)Sm-α-actin阳性细胞的定量（n=6）。(c（c）)qPCR检测转染Myocd的成纤维细胞Sm基因表达(d日)用含或不含miR-145的50 ng Myocd转染成纤维细胞（n=5）。(e（电子）)钙调素和Sm-α-肌动蛋白的Western blot。(（f）)使用所示抗体（绿色）对带有或不带有miR-145的神经嵴干细胞（Joma1.3 NCCs）进行免疫细胞化学；去除三苯氧胺（4OHT）以进行分化。Sm-α-actin+细胞相对于总Dapi+细胞核（蓝色）百分比的定量（n=6）。(克)miR-145表达的NCC中Sm基因表达的qPCR（n=5）；p75是未分化神经嵴细胞的标志物。(小时)Sm-α-actin和calponin的Western blot。(我)钙通量[Ca2+]我来自NCC或大鼠主动脉SMC的SMC在30秒时对内皮素-1（Et-1）刺激的反应。误差条显示SD.*，p<0.05。
图4
图4。miR-143和miR-145以促进VSMC分化和抑制增殖的因子网络为靶点
(一)引入后Cos细胞中的萤光素酶活性麋鹿-1CMV驱动荧光素酶报告子下游的3′UTR或突变型3′UTR-（mut），带有指示的miRNAs（n=5）。(b条)通过western blot评估转染打乱（scr）miRNA或抗miR-143或-miR-145的A10 VSMC细胞裂解液中的Elk-1蛋白。(c（c）)相对于对照组（5%FBS），抑制miR-143或miR-145后VSMC增殖（n=5）。(d日)Cos细胞中荧光素酶活性Myocd公司带有指示miRNAs的3′UTR序列（n=5）。Myocd结合位点（BS）在4倍连接的情况下发生突变。(e（电子）)wt或突变的荧光素酶活性Klf4公司-引入指示miRNAs后的3′UTR（n=5）。（f）western blot分析转染有指示抗miRs的A10细胞裂解液中的Klf4蛋白。(克)wt或突变的荧光素酶活性凸轮II-δ3′UTR（n=5）。(小时)转染scr miRNA或抗miR-145的A10细胞中CamkII-δ蛋白的Western分析。(我)VSMC相对于对照组的增殖（n=5）。误差线表示SD。由Image J.*进行的密度测定计算，p<0.05。
图5
图5。miR-143和miR-145调控平滑肌细胞增殖和分化的模型
miR-143和miR-145受SRF正向调节，并抑制多种因子，这些因子通常促进分化程度较低、增殖程度较高的平滑肌表型（紫色）。其中包括Klf4，它也抑制Myocd。miR-145对Myocd活性有积极影响，同时促进分化程度更高的平滑肌表型（粉红色），从而也起到增强自身表达的作用。miR-145和miR-143通过调节共同激活物和共同阻遏物来控制VSMC的增殖或分化表型，从而对SRF依赖性转录产生聚合作用。miR-145对Myocd的正调控导致miR-145和miR-143表达增强以及分化表型。虚线表示间接影响。
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