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.2009年10月；137（4）：1478-1488.e8。
doi:10.1053/j.gastro.2009.06.051。 Epub 2009年7月3日。

Hedgehog介导的非酒精性脂肪性肝病上皮-间充质转化和纤维化修复

Wing-Kin同步 1, 容美美（Youngmi Jung）, 阿莱西亚·奥梅内蒂, 马纳尔·阿卜杜勒马利克, 辛西娅·D·盖伊, 刘洋, 王江波, 拉斐尔·维特克, Caitlin M恐惧, 蒂亚戈·佩雷拉, 瓦妮莎·塔贝里, 史蒂夫·S·崔, 康德-万塞尔公司J, 游戏F卡拉卡, 安娜·梅·迪尔
附属公司

Hedgehog介导的非酒精性脂肪性肝病上皮-间充质转化和纤维化修复

Wing-Kin同步等。 胃肠病学. 2009年10月.

摘要

背景和目标：修复反应决定了肝病的最终结果。本研究评估了以下假设：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的纤维化修复是通过Hedgehog（Hh）通路激活和导管型祖细胞上皮-间充质转化（EMT）诱导介导的。

方法：在Hh抑制剂环胺存在或不存在的情况下，将未成熟的导管细胞暴露于Sonic hedgehog（Shh）中，以确定Hh途径激活是否直接调节肝祖细胞的EMT。使用喂食含或不含环胺的蛋氨酸-胆碱缺乏+乙硫氨酸（MCDE）饮食的小鼠评估祖细胞EMT的潜在生物学相关性。还比较了野生型（WT）和Patched单倍体不足（Ptc（+/-））小鼠在饮食诱导的NAFLD期间Hh信号增强对EMT和纤维生成修复的影响。最后，在NAFLD患者的肝脏切片中检测Hh途径激活和EMT的证据。

结果：在培养的祖细胞中，Shh抑制上皮基因和EMT抑制剂的表达，但诱导由肌成纤维细胞表达的基因。环磷酰胺逆转了这些作用。在小鼠NAFLD模型中，Hh途径激活、EMT、肌纤维母细胞数量增加和肝纤维化发生。环磷酰胺抑制Hh通路的激活和EMT的诱导。与WT小鼠相比，具有过度活跃的Hh通路的Ptc（+/-）小鼠表现出持续过度摄取Hh靶基因和更多的EMT、肌成纤维细胞积聚和纤维化。NAFLD患者中，表达EMT标记物的Shh产生细胞和Hh反应性导管细胞数量与肝纤维化平行增加。

结论：Hh介导的导管细胞EMT参与了NAFLD肝硬化的发病机制。

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数字

图1
图1。Shh配体诱导肝细胞Hh靶基因和EMT相关基因
在标准培养条件下保持未成熟的小鼠导管型祖细胞（603B）。添加重组Sonic hedgehog（Shh）蛋白（0，100，1000 ng/ml）24小时；采集细胞，通过QRT-PCR分析评估基因表达的变化。（a） gli1、α-sma、bmp7、分化抑制因子（id）2、角蛋白-7和e-cadherin。结果表示为相对于载体处理的对照培养物的折叠变化。绘制了重复实验的平均值±SEM。为了确定Shh的作用是否可直接归因于Hh信号传导，将603B细胞在Shh（100 ng/ml）和3uM环胺（一种特异性刺猬-对峙拮抗剂）或3uM托马替丁（一种非活性环胺类似物）存在下培养24小时；蛋白质由Western-blot采集并分析。（b） 这些研究的定量数据如补充图1所示*P<0.05或**P<0.005 vs 0 ng/ml Shh
图2
图2。用MCDE饮食快速诱导小鼠EMT相关基因诱导祖细胞依赖性肝再生
C57BL/6小鼠被喂食对照饮食或MCD饮食+0.1%乙硫氨酸（饮用水中）1周（MCDE饮食；n=4/组）。在治疗期结束时，通过QRT-PCR检测总RNA。（a） mpk、（b）gli2、（c）tgfβ、（d）s100A4、（e）波形蛋白和（f）bmp7。结果表示为相对于饲料对照组的折叠变化。绘制平均值±SEM。*与对照组相比，P<0.05或**P<0.005
图3
图3。Ptc饮食诱导的NASH过程中Hh靶基因诱导增加和肝纤维化+/-Hh通路过度活跃的小鼠
私人投资公司+/-给小鼠和野生型对照窝鼠（WT）喂食常规食物或蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）食物4周。在治疗期结束时，处死小鼠（n=4/组）。（a） gli2 mRNA的QRT-PCR分析；（b） WT和Ptc中Gli-2阳性导管细胞（白色条）和Gli2阳性肝细胞（实心条）的积聚+/-组。结果表示为相对于各饲料对照组的折叠变化，并绘制了平均值±SEM图；喂食WT（c）和Ptc的典型MCD饮食中Gli2的（c-d）免疫组织化学+/-（d） 小鼠-每个显微照片中的小插页在相应的饮食对照组中显示Gli2染色；（e） 治疗结束时胶原mRNA水平和（f）肝羟脯氨酸含量。结果表示为相对于相应的饲料对照组的折叠变化。绘制平均值±SEM。*与WT组相比，P<0.05或**P<0.005
图4
图4。Ptc饮食诱导NASH期间EMT相关基因表达的增强变化+/-老鼠
进行QRT-PCR分析，以评估图3图例中描述的小鼠肝脏总RNA中几个EMT相关基因的表达变化（a）tgfβ，（b）αsma，（c）mmp9，（d）timp1，（e）bmp7，（f）角蛋白-7。结果表示为相对于各个喂食对照组的折叠变化，并以平均值±SEM表示。*P<0.05 vs WT组
图5
图5。抑制Hh信号减弱体内EMT相关的纤维生成
WT小鼠在正常饮食（n=4）或MCDE饮食（n=8）中添加或不添加环胺（n=4/组；每只小鼠每天0.6mg；i.p.），喂养1周。治疗结束时，采集肝脏总RNA进行QRT-PCR（a）gli2，（b）tgf-β，（c）bmp7，（d）vimentin，（e）mpk。结果表示为相对于各饮食对照组的折叠变化，并以平均值±SEM表示。*与对照组或MCDE组相比P<0.05**与对照组相比P<0.005
图6
图6。NAFLD患者的Hedgehog通路激活
对16例特征明确的NAFL患者（n=5）、NASH患者（n=2）和NASH相关性肝硬化患者（n/6）的编码肝切片进行Hh-配体、Shh和Hh-靶基因Gli2染色。用计算机辅助形态计量学分析Shh染色。显微照片来自（a）NASH（NAFL中的小插入显示Shh染色）和（b）NASH相关肝硬化的代表性患者。（c） 所有患者Shh的定量分析。Shh的量表示为每高倍视野中染色细胞的百分比（放大倍数X400）。由盲法观察者在肝脏切片的10个高倍视野/切片中测定Gli2染色细胞的数量。（d）NASH中的Gli2染色（NAFL中的小插条显示Gli2着色）和（e）NASH相关肝硬化。（f） 对所有患者的Gli2进行定量分析。数据以Gli2细胞/高倍视野（放大倍数X400）的平均数±数量绘制*P<0.05或**P<0.005 vs NAFL
图7
图7。NAFL、NASH和NASH相关性肝硬化患者的EMT证据
图6图例中描述的患者的编码肝脏切片被染色以检测S100A4，这是一种来源于上皮细胞的成纤维细胞标记物。计算机辅助形态计量学分析S100A4染色。显微照片来自（a）NAFL、（b）NASH和（c）NASH相关肝硬化（放大倍数X400）的代表性患者。（d） NAFLD相关性肝硬化代表性患者S100A4染色的低倍镜（放大倍数x100）。（e） 所有患者S100A4定量分析。S100A4的数量表示为每个高倍视野中染色细胞的百分比*与NAFL相比，P<0.05或**P<0.005。（f） NASH相关性肝硬化中具有代表性的Gli2（棕色）和Vimentin（蓝色）双重免疫染色。Small Insert显示人类健康肝脏中的Gli2和vimentin双重染色（放大x630）。
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