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.2009年9月；19(9):1034-45.
doi:10.1093/glycob/cwp084。 Epub 2009年6月18日。

α-半乳甘露聚糖Davanat在不同于传统半乳糖苷结合域的位置结合半乳糖蛋白-1

米歇尔·米勒 1, 阿纳托利·克利约索夫, 凯文·梅奥
附属公司

α-半乳甘露聚糖Davanat在不同于传统半乳糖苷结合域的位置结合半乳糖蛋白-1

米歇尔·米勒等。 糖生物学. 2009年9月.

摘要

半乳糖凝集素是凝集素的一个亚家族，由其高度保守的β-三明治结构和结合β-半乳糖苷的能力定义，如半乳糖β1-4-Glc（乳糖）。在这里，我们使用（15）N-（1）H HSQC和脉冲场梯度（PFG）NMR光谱来证明半乳糖凝集素-1（gal-1）与相对较大的半乳甘露聚糖Davanat结合，其主链由β1-4键连接的d-甘露糖基单元组成，单个d-吡喃半乳糖基残基通过α1-6键定期附着在其上（重量平均MW为59 kDa）。Davanat结合域覆盖了gal-1表面上相对较大的区域，该区域主要在蛋白质与乳糖结合位点相对的一侧穿过二聚体界面。我们的数据表明，与乳糖的260 x 10（-6）M相比，gal-1结合Davanat的表观平衡解离常数（K（d））为10 x 10（-6M），并且每个Davanat分子的静态光度约为3到6 gal-1分子。甘露聚糖也在gal-1上的同一半乳甘露聚糖结合域上相互作用，但亲和力至少低10倍，支持Davanat中半乳糖单元对gal-1的相对强结合作用。我们还发现，在gal-1/Davanat复合物中，β-半乳糖苷结合域仍然可以访问，因为乳糖仍然可以结合，亲和力没有明显损失。此外，与Davanat结合的gal-1还改变了半乳甘露聚糖的超分子结构，并似乎减少了其流体动力学半径，破坏了聚糖间的相互作用，从而降低了聚糖介导的溶液粘度。总的来说，我们的发现有助于理解gal-1碳水化合物的相互作用，并为gal-1的功能及其潜在的重大生物学后果提供了见解。

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数字

图1
图1
达瓦那重复单元的化学结构。Davanat是一种半乳甘露聚糖，其骨架由（1→4）连接的β-d日-单个α对应的甘露糖基单位-d日-吡喃半乳糖残基通过（1→6）-键周期性地附着，平均重复单位为17β-d日-Man残基和10α-d日-Gal残基，以及包含大约12个此类重复单元的平均聚合物分子。
图2
图2
1H（H）-15含和不含Davanat的gal-1的N HSQC光谱。HSQC光谱如下所示15仅富含N的gal-1（1 mg/mL）(A类)gal-1:Davanat摩尔比为30:1(B类)和15:1(C类). 在每个曲线图下方提供光谱展开，以更好地可视化在向gal-1溶液中添加Davanat时观察到的共振增宽。扩展图中的共振用Nesmelova，Pang等人（2008）报告的赋值进行标记。
图3
图3
HSQC共振展宽图中的Gal-1/Davanat结合。在gal-1:Davanat摩尔比（20:1）下观察到gal-1共振强度的分数变化，其中大多数gal-1共振态相对于gal-1的氨基酸序列仍然明显。值为1表示与该特定残留物相关联的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。gal-1中的11条β-链被鉴定为低于残基数。插图显示了gal-1 HSQC共振强度相对于Davanat浓度（mg/mL）的平均分数变化（±SE）。实线表示每个点上这些值的平均值的S形拟合。
图4
图4
gal-1上的Davanat结合结构域。(A类)如文中所述，gal-1折叠结构上受Davanat结合影响最大的残留物以红色和橙色突出显示。图中使用了乳糖结合的人半乳糖凝集素-1的x射线结构（pdb访问代码：1gzw，Lopez-Lucendo等人）。左侧的方向显示Davanat结合的二聚体的表面。还显示了gal-1二聚体界面。右边的方向显示了二聚体的另一侧，乳糖在那里结合。(B类)Davanat结合域中gal-1残基的图示。极性残基、带正电残基和疏水残基分别用橙色、蓝色和绿色表示。作为参考，其结合位点中的乳糖分子显示为紫色。
图5
图5
甘露聚糖与gal-1结合的HSQC共振展宽图。甘露聚糖（16 mg/mL）存在时gal-1（4 mg/mL）HSQC共振强度相对于gal-1氨基酸序列的分数变化。值为1表示与该特定残留物相关联的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。gal-1中的11条β-链被鉴定为低于残基数。插图显示了交叉峰与甘露聚糖浓度（mg/mL）的平均分数强度变化（±SE）。实线表示这些数据的多项式拟合。
图6
图6
乳糖在Davanat存在下结合gal-1。(A类)两个HSQC谱的展开重叠15在Davanat（摩尔比10:1，gal-1:Davanat）（黑色交叉峰）的存在下，并添加1 mM（品红）、3 mM（红色）和10 mM（蓝色）的乳糖，富含N的gal-1（1 mg/mL）。(B类)两个HSQC光谱的展开叠加15单独添加富含N的gal-1（1 mg/mL）（黑色交叉峰），并添加1 mM（洋红）、3 mM（红色）和10 mM（蓝色）的乳糖。扩展图中的共振A类和B类标记为Nesmelova，Pang等人（2008）之前指定的.(C类)15N个-1向含有Davanat的gal-1溶液中添加乳糖后，观察到gal-1共振的H加权化学位移差（Δδ），如A类与gal-1的氨基酸序列相对。(D类)15N个-1将乳糖单独添加到gal-1溶液中时观察到的gal-1共振的H加权化学位移差（Δδ），如B类与gal-1的氨基酸序列相对。(E类)Davanat存在下gal-1的20个最大位移共振的分数化学位移变化（来自A类)作为乳糖浓度的函数。(F类)仅gal-1的20个最大位移共振的分数化学位移变化（来自B类)作为乳糖浓度的函数。两者中的实线E类和F类表示每个点上这些值的平均值的乙状拟合，如文中所述。
图7
图7
乳糖可减少达瓦那诱导的加宽。(A类)上图显示了在Davanat（10:1 gal-1:Davanat的摩尔比）存在下gal-1的共振强度相对于gal-1氨基酸序列的分数变化。值为1表示与该特定残留物相关联的共振不再明显，值为零表示共振强度没有变化。底图显示了在Davanat（摩尔比10:1 gal-1:Davanat）和1 mM乳糖存在下gal-1的共振强度相对于gal-1氨基酸序列的分数变化。(B类)绘制了Davanat存在下gal-1 28个共振的分数展宽与乳糖浓度的关系。显示的线条只是将数据点连接起来作为视觉辅助。
图8
图8
1Davanat核磁共振氢谱，以及gal-1滴定的扩散衰减曲线。(A类)A类1显示了Davanat的核磁共振氢谱图。插图说明了文中讨论的一些共振包络线的扩散介导的梯度诱导衰减。光谱下方的线提供了Gal和Man环蛋白质共振的化学位移范围，如文中所述。3.93 ppm时Davanat共振的扩散衰减曲线(B类)和3.694 ppm(C类)显示为gal-1浓度的函数，单位为mg/mL。聚糖浓度保持在4.6 mg/mL，并将gal-1滴定到溶液中。虚线表示对衰减曲线慢成分的Y轴截距的外推，如文中所述。
图9
图9
Davanat扩散系数。(A类)D类-绘制了去卷积扩散衰减曲线的慢分量的值与gal-1浓度的关系。(B类)文中讨论了指示标准聚糖和蛋白质扩散系数与其分子量的线。虚线表示蛋白质与聚糖结合的假设情况，其中复合物既不是蛋白质也不是聚糖，而是两者的某种组合。
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