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.2009年8月21日；284(34):22988-3000.
doi:10.1074/jbc。M109.020222。 Epub 2009年6月15日。

新型谷氨酸脱氢酶抑制剂：通过蛋白质动力学控制变构调节

李明 1, 克里斯托弗·史密斯, 马修·T·沃克, 托马斯·J·史密斯
附属公司

新型谷氨酸脱氢酶抑制剂：通过蛋白质动力学控制变构调节

李明（音）等。 生物化学杂志. .

摘要

哺乳动物谷氨酸脱氢酶（GDH）是一种同六聚体酶，以NAD（P）（+）为辅酶，催化l-谷氨酸可逆氧化脱氨基生成2-酮戊二酸。与其他动物王国的对应物不同，哺乳动物GDH由一系列配体调节。最近发现的高胰岛素血症/高氨血症障碍表明，GTP对GDH的变构抑制作用的丧失导致胰岛素过度分泌。随后的研究表明，绿茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素醋酸酯抑制GDH的野生型和高胰岛素血症/高氨血症形式。随后进行了高通量研究，确定了更稳定的抑制剂，包括六氯酚、GW5074和双硫醇。这里显示了GDH与这三种化合物络合的结构。六氯苯通过药物和GDH之间以及药物分子本身之间的芳香堆积相互作用，在GDH的内腔周围形成一个环。相反，GW5074和双硫醇都以堆叠化合物对的形式结合在亚单位二聚体之间的六聚体2倍轴上。当酶转化过程中催化间隙闭合时，GDH的内核收缩。这些药物都没有引起接触残基的构象变化，但都与收缩过程中的关键界面结合。因此，这些药物可能通过抑制这种转变来抑制酶的转换。事实上，这种扩张/收缩过程可能在GDH中观察到的亚单位间通讯和变构调节中起主要作用。

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数字

图1。
图1。
牛谷氨酸脱氢酶中配体结合位点的构象转换和位置。 A类，一个带状图apo-牛谷氨酸脱氢酶，每个相同的亚基由不同的颜色亚单位排列是一个三聚体的排列，其中反平行β链在相互叠加的亚单位之间形成广泛的相互作用。此配对表示为不同的色调的相同的颜色底物结合期间的构象变化由带编号的箭头当底物结合时，NAD+绑定域关闭(1). 天线的上升螺旋向相邻子单元的枢轴螺旋移动(2). 天线下降股的短螺旋在羧基端延伸和扭曲(三). 最后，螺旋的内腔压缩，使三对紧密相连(4).B类显示ADP的结构(绿色球体)与GDH的apo-form和Arg-463的位置有关(淡紫色球体)参与ADP激活（22）。C类显示了抑制剂GTP的位置(淡紫色球体)，受NADH约束(灰色球体)和谷氨酸(橙色球体)流产复合体。这个绿色箭头注意到5′-FSBA（48）修饰的两个位点之一（Lys-420）的大致位置。比较B类和C类催化间隙的闭合和枢轴螺旋的运动是明显的。
图2。
图2。
GDH和胰岛素稳态之间的联系。该图显示了GDH在BCH刺激的胰岛素分泌中的作用，以及GDH抑制剂如何影响这一过程（29，30）。在能量耗尽的β细胞中，BCH斜坡刺激胰岛素分泌。这里，主要的能量来源是通过磷酸依赖性谷氨酰胺酶和GDH进行的谷氨酰胺分解，因为GDH抑制剂（ATP/GTP）的浓度已经耗尽，磷酸依赖性的谷氨酰胺酶激活剂P我（无机磷酸盐）增加。BCH通过GDH激活刺激谷氨酰胺的利用，从而提供胰岛素分泌所需的ATP信号。GDH抑制剂通过抑制GDH活性来阻止这一过程。
图3。
图3。
这些化合物对牛GDH抑制作用的稳态动力学分析。显示在顶部是在这些结构研究中使用的并且先前在高通量筛选中鉴定的三种化合物的化学结构（32）。六氯酚（HCP）对氧化脱氨反应的影响已经得到证实（32）。如所示A类和C类是不同谷氨酸和双硫醇下的稳态速度(比思)或GW5074浓度。这个显著下降趋势在中曲线浓度高于16 m米谷氨酸是由底物抑制引起的，因此使用修正的Monod方程（方程1）对数据进行分析，并在表1中进行总结。如所示B类和D类是不同NAD下氧化脱氨反应的Lineweaver-Burk图+和药物浓度。这里，有一个标记的中断从～0.1 m处的预期线性米北美+由于负合作性（40）。这个V（V）最大值和K（K）米根据高NAD的数据估计+浓度和总结见表1。
图4。
图4。
与牛GDH·NADP结合的HCP的结构+·GLU·GTP综合体。 A类,立体带状图具有亚基的牛GDH有色的以类似于图1的方式。为清楚起见，其他结合配体（GTP、NADPH和谷氨酸）未显示在图表在中心核心，六个HCP分子中的每一个都由不同颜色的球体。B类,立体视图位于中央核心区，从顶部六聚体的三倍轴穿过天线。HCP的六份副本由球杆模型，并且它们相应的电子密度显示在1σ的等值线水平上。
图5。
图5。
HCP在GDH核心中的结合环境。 A类,带状和棒状图形GDH·HCP复合物，其中一些接触残留物突出显示。注意，总共有三个HCP分子在构象A中结合，三个在构象B中结合。方向是三重轴垂直穿过每个分子的中间面板. The颜色对应于亚单位颜色如图3所示。B类，一个立体图像使用类似的视图方向，显示GDH内部核心的立体图像，其中六个结合HCP分子中的三个分子表示为球杆模型.
图6。
图6。
结合双硫醇的电子密度和结合环境。这个看法和着色与顶部图3中，沿着2倍轴之一和垂直于3倍轴的方向看酶的核心。A类，一个立体图像双硫醇·GDH复合物的药物分子球杆模型并注意到接触残留物。B类，一个立体视图结合位点的原子表面，有色的根据所有其他数据。请注意，从六聚体的外部可以看到这个空腔。
图7。
图7。
结合GW5074的电子密度和结合环境。 A类,立体图像与图5中用于双硫醇的电子密度视图基本相同。B类，结合腔的分子表面。该结合位点与双硫醇相同。
图8。
图8。
所有结合配体的位置。该图的目的是阐明牛GDH上所有配体结合位点的位置。A类，一个带状图显示双硫醇的结构(球体具有各种颜色)、NADPH(灰色球体)，谷氨酸(黄色球体)、GTP(黑色球体)绑定到GDH。这个看法与图5相同，并显示双硫醇（和GW5074）分子围绕GDH亚基对相关的2倍轴结合。B类,立体图形显示了核心区域的剖切图，双硫醇和HCP的位置由彩色球体图中的视图位于三重轴下方，三个二重轴位于图形平面内，并在双硫醇对之间运行。请注意，HCP分子聚集在酶的核心，双硫醇和GW5074更多地结合在六聚体的外部。
图9。
图9。
酶的开放形式和封闭形式之间的构象差异。在这个立体图，封闭形式的亚单位的C-α主干为颜色较深而酶的排列开放形式的亚单位是以相应的较浅色调着色.谷氨酸结合域红色（闭合形式）亚单位与粉红色（开放形式）亚单位。由于亚单位的堆积二聚体起到刚体的作用，这也使深蓝色（闭合形式）亚单位浅蓝色（开放形式）亚单位。此区域由黄色方形.药物的一般位置由黄色圆圈. The黄色箭头突出核心区域中参与药物结合的螺旋，并在催化位点打开时分开。
图10。
图10。
GDH六个亚单位之间的各种载体示意图。颜色与其他颜色相同功能区图表，每个子单元由球强调二聚体构型的三聚体。六聚体有四种独特的距离；三聚体内的亚基之间(三元内)，在二聚体内的亚单位之间(内二聚体)以及每个亚基与另一三聚体上两个相对亚基之间的两个交叉载体(交叉向量1和2). 表3总结了与各种复合体的距离。
图11。
图11。
其他王国药物对GDH的影响。这里显示了不同浓度的三种药物对牛GDH的影响(红线)，四膜虫(绿线)和大肠杆菌(蓝色线条). 曲线拟合结果汇总在表4中。
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