Integrin alpha8beta1 regulates adhesion, migration and proliferation of human intestinal crypt cells via a predominant RhoA/ROCK-dependent mechanism

doi:10.1042/BC20090060

.2009年9月14日；101(12):695-708.

doi:10.1042/BC20090060。

整合素α8beta1通过主要的RhoA/ROCK依赖机制调节人类肠隐窝细胞的粘附、迁移和增殖

Yannick D Benoit公司¹, 卡琳·鲁西尔, 皮埃尔·亚历山大·杜夏尔, 索菲·西夫雷特, 林恩·施纳普, 努里亚·巴索拉, Jean-François Beaulieu女士

附属公司

PMID： 19527220
预防性维修识别码：项目经理2782361
内政部： 2009年10月12日/BC20060

整合素α8beta1通过主要的RhoA/ROCK依赖机制调节人类肠隐窝细胞的粘附、迁移和增殖

Yannick D Benoit公司等。生物细胞. 2009.

.2009年9月14日；101(12):695-708.

doi:10.1042/BC20090060。

作者

Yannick D Benoit公司¹, 卡琳·鲁西尔, 皮埃尔·亚历山大·杜夏尔, 索菲·西夫雷特, 林恩·施纳普, 努里亚·巴索拉, Jean-François Beaulieu女士

附属

¹CIHR消化上皮研究小组，解剖与生物细胞，医学与科学研究院，舍布鲁克大学，魁北克省舍布鲁克，加拿大，J1H 5N4。

PMID： 19527220
预防性维修识别码：项目经理2782361
内政部： 2009年10月12日/BC20060

摘要

背景：整合素是跨膜α-β-异二聚体受体，在细胞骨架和ECM（细胞外基质）分子之间起结构和功能桥梁的作用。RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽基序）依赖性整合素α8beta1已被证明参与神经元和间质衍生细胞类型的各种细胞功能。其在上皮细胞中的作用尚不清楚。

结果：整合素α8beta1在人类肠道的隐窝细胞群中表达，但在绒毛的分化和成熟上皮细胞中不表达。使用正常HIEC（人类肠上皮细胞）在细胞水平上研究了上皮隐窝细胞中α8beta1的功能。使用shRNA（small-hairpin RNA）方法特异性敲除α8亚单位表达表明，α8beta1通过RhoA/ROCK（Rho-associated kinase）依赖机制在RGD依赖的细胞粘附、迁移和增殖中发挥重要作用，如活性RhoA定量和ROCK的药理抑制所示。此外，α8beta1通过RhoA/ROCK丢失，损害了FA（局灶黏附）复合体的完整性，正如错误的vinculin募集所证明的那样。

结论：整合素α8beta1在上皮细胞中表达。在肠隐窝细胞中，α8beta1通过主要的RhoA/ROCK依赖机制，密切参与粘附、迁移和细胞增殖的调节。这些结果表明，该整合素在肠隐窝细胞同质化中起着重要作用。

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数字

**图1。整合素α8亚单位在肠细胞中的表达随着分化而丧失**
(A类)代表性RT-PCR，表明α8亚单位（Intα8）转录物在HIEC祖细胞中强烈表达，在融合的不同阶段（融合后0、+5和+10天）分化Caco-2/15细胞时无此转录物，由蔗糖酶-异麦芽糖酶（SI）表达监测。(B)Westernblot分析证实了α8在HIEC蛋白水平上的表达。(C类)稳定HIEC细胞系中α8亚单位转录表达的代表性RT-PCR，有无GATA-4的异位表达。RPLP0作为正常化基因，DPPIV作为分化标记。

**图2。α8整合素亚基在人小肠中的表达和分布**
14周时人体空肠冷冻切片的典型免疫荧光显微照片(A类,C类)怀孕20周(B,D类)用抗α8整合素亚单位抗体染色。在这两个阶段，在隐窝区域（由A类和B). 对隐窝区域进行更高的放大显示，在14周和20周时，α8亚单位存在于上皮隐窝细胞（E）的基底外侧表面（箭头）(C类,D类). 14周时，间质（M）呈弱染色，而20周时，随着平滑肌细胞的分化，标本的染色更为显著。比例尺：(A类,B)50μm和(C类,D类)25微米。(E类)RT-PCR实验证实18-20周空肠上皮中存在α8转录物（Intα8），并伴有间质中的强表达。上皮（E）和间充质（M）组分纯度分别通过缺乏波形蛋白和E-cadherin（E-Cad）进行验证。

**图3。整合素α8β1与RGD依赖的人肠隐窝细胞粘附**
(A类)在含有GST或RGD的GST–TNfn3涂层上对HIEC细胞进行短期（1小时）粘附试验。用针对HIEC表达的RGD结合整合素的中和抗体处理或不处理细胞。小鼠IgG用作阴性对照(n个≥3; **P（P）*<0.05; ***P（P）*<0.01，与小鼠IgG相比）。(B)Western blotting评估wt（野生型）HIEC以及HIEC/shCNS和HIEC/shα8的稳定细胞群中α8（Intα8）、αv（Int alv）和β1（Intβ1）蛋白表达水平。(C类)根据载荷控制角蛋白18（K18）检测各组α8、αv和β1的相对量(n个=3; ****P（P）*<0.0001). (D类)用HIEC/shCNS和HIEC/shα8细胞在GST、含有RGD的GST-TNfn3或RAA-突变的GST-TNfn3涂层上进行长期（24小时）粘附试验。将环己酰亚胺（10μg/ml）添加到粘附介质中，以避免内源性纤维连接蛋白分泌/沉积(n个=4; ****P（P）*<0.0001).

**图4。整合素α8β1调节局部接触和应力纤维组织**
HIEC/shCNS上肌动蛋白应力纤维（红色）的长春花蛋白免疫荧光（绿色）和TRITC-鬼笔肽染色的代表性显微照片(A类)和HIEC/shα8(B)播种后24小时(n个=4; 比例尺：50μm）。(C类)HIEC/shCNS和HIEC/shα8中每个细胞的病毒素染色FA的定量(n个=8; ****P（P）*<0.0001). (D类)Western blot检测两种细胞群中的文丘里表达水平(n个=3).

**图5。HIEC中整合素α8β1和RhoA GTPase的激活**
正常HIEC肌动蛋白应力纤维（红色）的小病毒免疫荧光（绿色）和TRITC-指骨样蛋白染色的代表性显微照片(A类)和Y-27632处理（20μM）HIEC(B)播种后24小时内(n个=3; 比例尺：50μm）。RhoA在总蛋白和膜分离蛋白提取物中的Western blot分析(C类)来自HIEC/shCNS和HIEC/shα8细胞(n个=3). (D类)使用带有HIEC/shCNS和HIEC/shα8的rhotekin-RhoA-结合域的珠进行活性RhoA下拉实验(n个=4; ***P（P）*=0.005). 整合素β1。

**图6。整合素α8亚基的敲除影响HIEC中长春花蛋白的定位，但不影响帕西林的定位**
(A类—D类)维库林（绿色）的代表性显微照片(A类,B)和帕西林（红色）(C类,D类)HIEC/shCNS的免疫荧光检测(A类,C类)和HIEC/shα8细胞(B,D类)播种后24小时。(E类,F类)HIEC/shCNS中vinculin和paxillin的合并图像(E类)和HIEC/shα8(F类)说明在α8-敲除条件下这两种蛋白质的差异细胞定位(n个=3; 比例尺：25μm）。

**图7。沉默α8亚单位增加HIEC细胞系的迁移**
显示迁移的HIEC/shCNS的相位对比显微照片(A类)和HIEC/shα8细胞(B)在2 mM羟基脲存在下孵育48小时后穿过伤口边缘(n个=5; 比例尺：100μm）。(C类)直方图表示穿过伤口边缘迁移的细胞数量(n个=5; ****P（P）*<0.0001).

**图8。整合素α8β1与HIEC细胞系的细胞周期进展**
显示BrdU标记细胞百分比的直方图(A类)HIEC/shCNS与HIEC/shα8的比较(B)与Y-27632处理的HIEC/shCNS和HIEC/shα8相比，未处理的HIEC/shCNS(****P（P）*<0.0005). (C类)细胞周期蛋白D1和p27数量的量化^基普1在HIEC/shCNS和HIEC/shα8中进行。（i）西部片分析；（ii）细胞周期蛋白D1和p27的相对量^基普1根据负荷控制肌动蛋白检测各组(n个=3; **P（P）*=0.012). (D类)图示每个G中分布的细胞百分比的直方图₁、S和G₂+根据iCys LSC分析，HIEC/shCNS和HIEC/shα8的M细胞周期阶段(n个=3; **P（P）*=0.015, ****P（P）*=0.0002).

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1. Babyatsky M.W.、Podolsky D.K.《胃肠道的生长和发育》。作者：Yamada T.，编辑。胃肠病学教科书。费城：J.B.Lippincott；1999年，第547-584页。
1. Barry S.T.，Critchley D.R.瑞士3T3细胞中依赖RhoA的局灶性粘连组装与酪氨酸磷酸化增加以及pp125FAK和蛋白激酶C-delta向局灶性黏附的募集有关。细胞科学杂志。1994;107:2033–2045.-公共医学
1. Basora N.、Vachon P.H.、Herring-Gillam F.E.、Perreault N.、Beaulieu J.F.人类肠细胞中整合素α7Bβ1表达与肠细胞分化之间的关系。胃肠病学。1997;113:1510–1521.-公共医学
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[8] Basora N.、Vachon P.H.、Herring-Gillam F.E.、Perreault N.、Beaulieu J.F.人类肠细胞中整合素α7Bβ1表达与肠细胞分化之间的关系。胃肠病学。1997;113:1510–1521.-公共医学

[9] Beaulieu J.F.细胞外基质成分和整合素与人类肠上皮细胞分化的关系。掠夺。组织化学。细胞化学。1997;31:1–78.-公共医学

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