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.2009年6月10日；4（6）：e5845。
doi:10.1371/journal.pone.0005845。

维甲酸信号传导沿整个前后轴组织内胚层器官规格

埃尔克·巴哈 1, 梅特·乔根森, Palle Serup公司, 安妮·格拉宾-波顿
附属公司

维甲酸信号传导沿整个前后轴组织内胚层器官规格

埃尔克海湾等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：羊膜动物的内胚层器官原基在原肠胚形成和肠管折叠之间形成。虽然RA信号对少数个别内胚层器官发育的要求已经确立，但尚未对其沿整个前后轴的活动进行系统评估。

方法/主要发现：RA是在靠近发育中的肠管的中胚层从原肠胚形成到体细胞发生的过程中合成的。在鳃弓区RA信号传导控制器官边界的特定水平。形成甲状腺的最前内胚层是在缺乏RA信号的情况下指定的。前鳃弓RA增加导致甲状腺原基抑制和更多后标志物的诱导，如鳃弓Hox基因。相反，RA信号的减少会将Hox基因向后转移到内胚层。这些结果表明RA在咽部内胚层中以分级方式起着尾化因子的作用。后前肠和中肠器官原基也需要RA，但将内胚层暴露于额外的RA不足以将这些原基向前扩张。我们发现，在小鸡中，与非羊膜相比，RA信号不仅在原肠胚形成期间是必需的，而且在体节发生期间贯穿肠管折叠。我们的结果表明，中肠标志物CdxA的诱导和胰腺的诱导需要内胚层中直接的RA信号。此外，CdxA（+）细胞之间的通讯是维持CdxA表达所必需的，因此中肠原基的细胞是同步的。我们进一步表明RA途径在内胚层模式中与FGF4协同作用，而不是介导FGF4活性。

结论/意义：我们的工作确立了维甲酸（RA）信号调节鸡胚中不同内胚层器官沿前后轴的位置，并可作为特定内胚层脏器与ES细胞分化的基础。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：P.Serup和M.C.Jörgensen是Novo Nordisk A/S（丹麦）的员工和股东。

数字

图1
图1。内源性RA信号在内胚层被激活。
整个底座就地杂交分析拉尔德2（A–D），Cyp26A1细胞（E–H），RARα（I–M），RARβ（N–R）和RARγ（S–W）在原肠胚形成或早期体细胞发生时。完整的坐骑照片、腹部视图、顶部前面都显示了确切的阶段。15µm冰冻切片显示在（C、D、G、H、K–m、P–R、U–W），背面到顶部。红色箭头表示内胚层中的表达，蓝色箭头表示PS中的细胞，绿色箭头表示外胚层，白色箭头表示拉尔德2体节和LPM中的表达。整个底座上的黑线表示截面的相对平面。比例尺为100µM。（十） RT-PCR分析风险调整比率在HH10期收获的内胚层和中胚层中的表达。测量所得条带的积分密度，并将其归一化为微管蛋白表达式。每个样品都是双份的，条形图显示了平均值。误差线表示标准偏差。AE，轴向内胚层；LPE，侧板内胚层；LPM，侧板中胚层；SM，体节中胚层。
图2
图2。外源性RA激活内胚层中的异位基因转录。
（A） 是一个示意图，显示了HH 4阶段RA珠的初始嫁接位置−或HH 10鸡胚。（B–I）显示整个底座就地杂交分析Cyp26A1细胞对照组（B，F），RA珠移植（C，G）或抑制剂处理的胚胎（D，H），腹视图，顶部前面。将珠子浸泡在乙醇（对照）或含有10−3将M RA和移植到内胚层，6小时后进行分析（分别约为HH 5或HH 11）。为了抑制，胚胎用10−5M AGN193109在HH 3添加到培养基中+或HH 10，孵育6小时，然后进行分析（分别约为HH 4-5或HH 11）。每张图片都给出了嫁接的确切阶段和分析。珠子的位置由一个圆圈标记，线条给出了（E和I）中所示的截面平面，腹侧朝下。比例尺为100µM。注意（E）中的宽诱导和（I）中的单侧腹侧诱导。A、 前部；h、 小时；P、 后部。
图3
图3。RA对咽内胚层进行分级。
RA珠子（10−3M） 在HH10将对照珠嫁接到内胚层，并根据特异标记表达的时间（D、E、G、H、J、K、M、N）对不同阶段的胚胎进行分析。十六进制在HH 4和HH 5（A，B）移植的胚胎中也进行了表达分析。在HH 3阶段进行RA抑制+或通过添加10−5M AGN193109加入培养基（C、F、I、L、O）。每张图片都显示了治疗和分析的确切阶段。整个底座就地杂交分析胚胎十六进制（A–F），Nkx2.1个（G–I），探头1（J–L）和霍克斯B4（M–O）。在的侧面视图中Nkx2.1个（G-I），去除表面外胚层以更好地观察染色。方框（K）显示放大倍数较高探头1RA治疗的抑制作用。虽然是肝脏十六进制E中的表达可能会减少，这是不可重复观察到的。黑线表示AIP的中线。霍克斯B4在所有三个胚层中都有表达，因此，内胚层中的诱导已经通过在相应的整个胚胎中用黑线标记的15µm切片（P，Q）进行了验证。前部始终位于顶部，但在（G–I）中，前部显示在左侧。比例尺为100µM。星号标记耳泡。黑色箭头表示RA处理的胚胎中甲状腺基因表达缺失。黑色箭头表示丢失十六进制或探头1表达式。蓝色箭头表示甲状腺正常表达十六进制或Nkx2.1毫米.绿色箭头指向肝芽。红色箭头表示异位十六进制表达式。白色箭头标记前脑表达Nkx2.1个.圆圈标记嫁接珠子的位置。
图4
图4。RA对后前肠和中肠结构域的形成至关重要。
胚胎用10−6HH 10（B，E）或10时培养基中的M RA−5M AGN193109在HH 4（C，F，G）或HH 8（D，E）阶段的培养基中。每张图片都显示了治疗和分析的确切阶段。前部始终位于顶部。整个底座的腹视图就地表达Pdx1页（A–C）和CdxA公司（D–G）。RA激活对Pdx1页或CdxA公司（B、E）。抑制RA导致完全抑制Pdx1页（C） 和两种不同的表型CdxA公司其表达被完全抑制（F，63%）或向后转移（G，37%）。黑色箭头指向AIP。黑色箭头显示的是CdxA公司表达式。请注意，F中的胚胎没有正确形成AIP。整个底座的侧视图就地杂交Nkx6.2个在HH8（4个体节）至HH16–17（H–K）阶段的培养基中暴露指示量的AGN193109后。Nkx6.2毫米胰腺中的表达逐渐减少，而神经系统中的表达则不受影响。暴露于指定量的AGN193109（L–O）后，通过对Pdx1（胰腺和十二指肠，绿色）、Nkx6.1（胰腺和十二指肠亚群，蓝色）和胰高血糖素（α细胞，红色）的全量免疫染色，在HH 19期评估随后的器官发生。前部始终位于顶部。（DP）背胰腺（VP）腹胰腺。
图5
图5。主要负RAR的电穿孔被废除CdxA公司表达和胰腺形成。
电穿孔pCIG（A、B、G、I、K）或pCIG-DNRAR（C–F、H、J、L）。整个底座就地HH 19期胚胎杂交显示CdxA公司在闭合的十二指肠和开放的中肠中表达（蓝色）。CdxA公司DN-RAR部分或完全抑制表达（n=7/11，C）或完全抑制（n=3/11，F）。表达表达结构的细胞通过免疫细胞化学标记双顺反子结构表达的GFP（D、F和H中绿色，用蓝色遮蔽CdxA公司B中染色，G中DAB-棕色），表明抑制延伸到靶细胞的相邻区域。HH 20期胚胎的整体免疫细胞化学显示，显性阴性RAR（用GFP示踪，绿色）以非细胞自主方式（J）抑制胰腺祖细胞的出现（用Nkx6.1示踪，红色），而对照胚胎用空载体（I）电穿孔。胰高血糖素+细胞仍能分化（蓝色）。（K和L）胚胎的选定光学切片分别显示在（I）和（J）中。比例尺200µm。
图6
图6。RA和FGF4独立于前内皮层。
整个底座就地杂交分析十六进制表达式。腹部视图，位于顶部前方。（A–D）FGF4信号被激活而RA信号被抑制时的胚胎分析。胚胎在HH 3期接受治疗+以二甲基亚砜和PBS珠接枝物（A）为对照，以二甲基亚砜处理并接枝FGF4珠（1 mg/ml）（B），用10−5M AGN193109并嫁接PBS珠（C），或用10−5M AGN193109，并用FGF4珠（1mg/ml）接枝（D）。圆圈显示珠子在（A–D）中的位置。（E–H）FGF4信号被抑制而RA信号被激活时的胚胎分析。胚胎在HH 3期接受治疗+以二甲基亚砜和乙醇（E）为对照，以二甲基亚砜和10为对照−6M RA（F），使用20µM SU5402和乙醇（G），或使用10−6M RA和20µM SU5402（H）。治疗在HH3期进行+6小时后，在HH 4-5期对24个胚胎进行分析。每张图片都显示了治疗和分析的确切阶段。（一） FGF4活性与RA无关。胚胎被处理并分析为（E–H）。“长度十六进制计算胚胎的结构域/长度”比率（%）（DMSO/乙醇n=10，DMSO/RA n=8，SU5402/乙醇n=9，SU5402/RA n=6）。图中的条形图表示平均值，误差条形图显示平均值的标准误差。P值小于0.001（学生t吨试验）在对照组和RA处理的胚胎之间，以及RA处理的和RA/SU5402处理的胚胎（两个星号）之间。P值小于0.05（学生t吨试验）。RA/SU5402与对照胚胎无显著差异。
图7
图7。内胚层RA和FGF的AP模式。
在原肠形成和早期体细胞发生时，RA在胚胎的后部合成，其前缘位于预期的前肠和后肠之间的交界处。RA降解酶Cyp26A1细胞在前面表达，作为RA分子的细胞内汇（左上方）。中间区域可能形成RA梯度。同时，FGF在节点和沿整个AP轴分级作用的后条纹中表达（右上面板）。在HH 10阶段，RA信号的分级激活可能维持在6第个体节和前肠，而LPE不断暴露于RA（下图）。FGF在尾芽的尾部产生（左下面板），再次沿AP轴分级作用。在后部，RA可能与FGF形成一种相反的物质，FGF相互拮抗，如前叶中胚层所示。不同水平的信号梯度诱导不同的基因转录。FGF是否也在后部BA水平诱导基因尚不清楚（右下角）。颜色代码在旁边的图例中解释。橙色虚线代表假定的神经板。侧板内胚层；LPM，侧板中胚层。
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