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临床试验
.2009年9月3日；114(10):2077-86.
doi:10.1182/bloud-2008-07-167510。 Epub 2009年6月8日。

AAV-1介导的人类骨骼肌基因转移导致衣壳特异性T细胞的剂量依赖性激活

费德里科·明戈齐 1, 詹妮克·梅伦伯格（Janneke J Meulenberg）, 丹尼尔·J·惠, 艾蒂安娜·巴什内尔·塔卡扬（Etiena Basner-Tschakarjan）, 妮可·C·哈斯布鲁克, Shyrie A Edmonson女士, 娜塔莉·哈特尼克, 迈克尔·贝茨, 约翰·卡斯特林, 埃里克·斯特罗斯, 凯瑟琳A高中
附属公司
临床试验

AAV-1介导的人类骨骼肌基因转移导致衣壳特异性T细胞的剂量依赖性激活

费德里科·明戈齐等。 血液. .

摘要

在一项针对脂蛋白脂肪酶（LPL）缺乏症的腺相关病毒血清1型（AAV-1）介导的肌肉基因转移临床试验中，来自高剂量组的1名受试者在基因转移4周后出现肌肉酶肌酸激酶（CPK）的短暂升高。同时，在与LPL表达一致的初始下降趋势后，血浆甘油三酯水平恢复到基线水平。我们在本研究中登记的受试者中描述了B细胞和T细胞对载体和转基因产物的反应。对经历CPK升高的受试者的外周血单个核细胞（PBMC）进行IFN-γ酶联免疫吸附斑点（ELISpot）和细胞内细胞因子染色检测，结果显示衣壳特异性CD4（+）和CD8（+）T细胞激活。8名受试者中有4名受试者对衣壳有可检测的T细胞反应，表现出剂量依赖性动力学。衣壳蛋白可检测到T细胞反应的受试者也具有较高的抗AAV-1 IgG3抗体滴度。没有受试者对LPL转基因产品产生B或T细胞反应。这些发现表明，针对AAV-1衣壳的T细胞反应具有剂量依赖性。它们是否也限制了高剂量转基因表达的持续时间尚不清楚，需要在以后的时间点进行额外的分析。

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数字

图1
图1
受试者E的血浆TG和血清CPK水平.垂直虚线表示给药时间；TG水平以毫升/升（mM）表示，CPK以国际单位/升（IU/L）表示*衣壳IFN-γELISpot阳性。CPK:ULN 190 IU/L；TG：正常水平小于2 mM，LPL研究纳入标准大于10 mM。受试者E基因转移前（−42至0周）的平均（±SD）TG为42.7 mM（±9.3 mM）（阴影区）。
图2
图2
受试者E PBMC上衣壳特异性IFN-γELISpot.（A）衣壳特异性IFN-γELISpot；结果以SFU/10表示6PBMC（平均值±标准偏差）。误差条代表SD.P1至P24，AAV肽矩阵池。显示阳性池（阳性定义为至少比介质控制高3倍，至少50 SFU/106PBMC）。水平线代表积极性的截止点。PMA表示阳性对照（>1000 SFU/106所有时间点的PBMC）；M、 仅中等。（B） 结果的矩阵分析。在任何时间点由阳性池识别的肽都显示在黑框中。请注意，肽145和146包含在基质池12和13中。
图3
图3
衣壳特异性T细胞的功能表征（A）受试者E第6周PBMC的细胞内IFN-γ染色；数字表示CD4的百分比−CD8（CD8）+干扰素-γT细胞+细胞在正向和侧向散射、单重态和CD4上门控−CD8（CD8）+T细胞。（B） 3个独立细胞内IFN-γ染色实验的表现（CD4百分比的平均值±标准偏差−CD8（CD8）+干扰素-γ+T细胞）。（C） 主题E的PBMC上的Perforin ELISpot。Medium表示仅介质控制；无关，人视网膜色素上皮65蛋白；AAV-1、AAV-1衣壳；CEF肽库阳性。数据以每10个SFU表示6PBMC。每10个SFU6比较AAV-1和培养基对照组的PBMC(P（P）=0.008）、AAV-1和无关控制(P（P）=0.007）、AAV-1和阳性对照(P（P）>.05，不显著）。
图4
图4
用IFN-γELISpot测定T细胞对AAV-1衣壳反应的时间进程每个横条代表一个单独的主题；肌肉注射后的时间（以周为单位）由垂直线表示。灰色条表示ELISpot结果为负值；红色条表示ELISpot结果为正。当平均SFU/106PBMC高于培养基对照的3倍，且至少为50 SFU/106用于AAV-1肽库和AAV-1空颗粒抗原的PBMC。图左侧显示了两组受试者接受的载体剂量，单位为每公斤基因组拷贝数（gc/kg）*AAV-1空衣壳为阴性。
图5
图5
CD4细胞+和CD8+T细胞耗竭实验.PBMC上的IFN-γELISpot，或PBMC的CD4-或CD8-缺失部分（CD4−CD8（CD8）+或CD4+CD8（CD8）−分别）。在第19周（受试者A）和第12周（受试验者D）采集样本。结果以SFU/10表示6细胞作为3个重复的平均值（±SD）。肽79/80表示先前通过筛选ELISpot在受试者A中鉴定的15个mers；先前通过筛选ELISpot在受试者D中鉴定的肽49，15-mer；中、阴性对照；PMA、阳性对照（PMA和离子霉素）。
图6
图6
T细胞对AAV衣壳蛋白的反应用一组覆盖AAV衣壳蛋白序列的15肽刺激PBMC 6小时，并用多色流式细胞术评估细胞因子反应。（A） 肿瘤坏死因子-α对CD4衣壳蛋白的反应+和CD8+T细胞。右上角的数字表示CD4应答的百分比+或CD8+T细胞。每个时间点至少收集了240 000个事件。（B） 应答TNF-α的免疫表型+细胞（红点）与总CD4的比较+T细胞（灰度密度图）。细胞在正向和侧向散射CD3上被选通+细胞，CD14−CD16型−CD20型−细胞。细胞也用Invitrogen胺活性活/死水染料染色。
图7
图7
AAV-1衣壳对T细胞反应的多功能分析在基线和基因转移后测量IL-2、IFN-γ、穿孔素、TNF-α和CD107的同时表达。饼图表示衣壳特异性CD4的比例+（左）或CD8+（右）表达1、2、3、4或5标记的T细胞。细胞在正向和侧向散射CD3上被选通+细胞，CD14−CD16型−CD20型−细胞。细胞也用Invitrogen胺活性活/死水染料染色。CD4细胞+或CD8+对T细胞进行IL-2、IFN-γ、穿孔素、TNF-α和CD107表达分析，以响应AAV-1肽对培养基对照的反应。
图8
图8
抗AAV-1抗体亚类分析.血清IgG1、IgG2、IG3、IgG4和IgM水平（平均±SD，ng/mL）。♦ 表示受试者对ELISpot测定的AAV衣壳有阳性T细胞反应（受试者A、D-E和H）；公式图像，ELISpot检测到对AAV衣壳没有检测到T细胞反应的受试者（受试者B-C、F-G）*P（P）< .05.
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中的注释

  • 通过AAV免疫进行肌肉训练。
    VandenDriessche T。 VandenDriessche T。 鲜血。2009年9月3日；114(10):2009-10. doi:10.1182/bloud-2009-07-228510。 鲜血。2009 PMID：19729532

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