Akt and 14-3-3 control a PACS-2 homeostatic switch that integrates membrane traffic with TRAIL-induced apoptosis

doi:10.1016/j.molcel.2009.04.011

.2009年5月14日；34（4）：497-509。

doi:10.1016/j.molcel.2009.04.011。

Akt和14-3-3控制PACS-2稳态开关，该开关将膜交通与TRAIL诱导的细胞凋亡结合在一起

约瑟夫·阿斯兰¹, 惠鸿游, 丹妮尔·威廉姆森, 杰西卡·恩迪格, 罗伯特·T·尤克, 劳雷尔·托马斯, 舒红军, 于洪都, 罗伯特·米洛夫斯基, Matthew H笔刷, 安东尼·波塞马托, 坎·斯普洛特, 海安福, 肯尼斯·格雷斯, 道格拉斯·伦克尔, 阿恩特·沃格尔, 加里·托马斯

附属公司

PMID： 19481529
预防性维修识别码：项目经理2744858
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2009.04.011

Akt和14-3-3控制PACS-2稳态开关，该开关将膜交通与TRAIL诱导的细胞凋亡结合在一起

约瑟夫·阿斯兰等。分子电池. 2009.

.2009年5月14日；34(4):497-509.

doi:10.1016/j.molcel.2009.04.011。

作者

约瑟夫·阿斯兰¹, 惠鸿游, 丹妮尔·威廉姆森, 杰西卡·恩迪格, 罗伯特·T·尤克, 劳雷尔·托马斯, 舒红军, 杜玉红, 罗伯特·米洛夫斯基, Matthew H笔刷, 安东尼·波塞马托, 坎·斯普洛特, 海安福, 肯尼思·德·格雷斯, 道格拉斯·伦克尔, 阿恩特·沃格尔, 加里·托马斯

附属

¹美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学沃伦研究所，邮编97239。

PMID： 19481529
预防性维修识别码：项目经理2744858
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2009.04.011

摘要

TRAIL选择性地杀死体内的病变细胞，激发了人们对这种死亡配体作为潜在治疗药物的兴趣。然而，许多癌细胞对TRAIL具有耐药性，这表明TRAIL诱导凋亡的机制是复杂的。在这里，我们确定PACS-2是一种必需的TRAIL效应器，在体外杀死肿瘤细胞和在体内杀死病毒感染的肝细胞所必需。PACS-2在体内被Ser437磷酸化，药理学和遗传学研究表明Akt是一种体内Ser437激酶。Akt与14-3-3合作调节PACS-2调节TRAIL作用的稳态和凋亡特性。磷酸化Ser437以高亲和力结合14-3-3，抑制PACS-2的凋亡活性，是PACS-2介导膜转运所必需的。TRAIL触发Ser437去磷酸化，重新编程PACS-2以促进凋亡。总之，这些研究将PACS-2 Ser437的磷酸化状态确定为一种分子开关，将细胞内环境稳定与TRAIL诱导的凋亡结合在一起。

PubMed免责声明

数字

**图1。TRAIL介导的肿瘤细胞死亡需要PACS-2**
**（A）**用pmaxGFP和对照siRNA（scr.）或PACS-2 siRNA（#1，Qiagen，#2，Dharmacon）联合对HCT116细胞进行核感染，然后用0、10或100 ng/ml TRAIL处理16小时⁺流式细胞术检测细胞凋亡。数据以平均+/-SEM表示。插图：对照组和PACS-2敲除细胞中PACS-2的Western blot。**（B）**将来自8名患有转移癌（样品1-3）或3期癌（样品4,6,8-10）的志愿者的匹配结直肠癌（T）和邻近正常（N）结肠组织均质化，并用western blot分析每个样品中100μg的总蛋白。箭头，PACS-2；*，身份不明的150kDa PACS-2免疫反应蛋白。**（C）**结肠肿瘤石蜡块切片，免疫组化分析PACS-2的表达。左，正常结肠上皮（N）和邻近肿瘤（T）。右，正常和肿瘤区域的放大。

**图2。体内TRAIL介导的细胞凋亡需要PACS-2**
**（A）**VICTR37逆转录病毒基因陷阱插入小鼠PACS-2基因的内含子1。基因陷阱（PACS-2^{燃气轮机（OST426086）})产生一个截短的蛋白质嵌合体，只包含889个氨基酸PACS-2的前40个氨基酸。外显子1和11上方的箭头表示拼接供体位点B组SD中使用的PCR引物；SA，拼接受体。**（B）**从PACS-2 WT（PACS-2）中分离出RNA^+/+)，杂合子（PACS-2^{+/燃气轮机（OST426086）}，以下简称PACS-2^+/-)或PACS-2基因陷阱（（PACS-2^{GT（OST426086）/GT（OST428086）}，以下简称PACS-2^-/-)通过RT-PCR检测PACS-1、PACS-2和ATP柠檬酸裂解酶（ACYL，阳性对照）。**（C）**用免疫印迹法分析WT、+/-或-/-小鼠的组织中的PACS-2。**（D）**WT和PACS-2^-/-给小鼠（每组n=4）注射AdGFP和小鼠AdTrail。在WT和PACS-2的肝切片中计数TUNEL和c-caspase-3阳性细胞^-/-观察小鼠（放大200倍）并量化为每20倍视野中TUNEL和裂解caspase 3阳性细胞的数量（图表）。油红O染色检测肝脂肪变性。**（E）**WT和PACS-2^-/-小鼠（每组n=4）注射mAb Jo2以刺激Fas介导的细胞凋亡，或注射LPS/GalN以刺激TNFα介导的细胞凋亡，并计数TUNEL阳性细胞核（原始放大倍数200x）。

**图3。PACS-2是TRAIL诱导SV40大T抗原转化MEF凋亡所必需的**
**（A）**初级WT和PACS-2^-/-MEF以及TAg-WT、TAg-PACS-2^-/-，标签PACS-2^五或标签PACS-2^R（右）用增加浓度的TRAIL处理MEF 16小时，然后通过Annexin V/碘化丙啶染色分析细胞凋亡。培养物中PACS-2和DR5表达的插入、western blot。数据表示为平均+/-SEM。**（B）**TAg-WT和TAg-PACS-2的裂解产物^-/-用caspase-8底物Ac-IETD-AFC或caspase-3底物Ac-DEVD-AFC孵育MEF，并量化游离AFC荧光。数据表示为平均+/-SEM。**（C）**标签-WT和标签-PACS-2^-/-MEF用50 ng/ml TRAIL处理指定时间，并用western blot测定每个凋亡因子的裂解。肌动蛋白，加载控制。**（D）**标签-WT和标签-PACS-2^-/-用25 ng/ml TRAIL处理MEF或不处理MEF 4小时。用洋地黄素使细胞渗透，通过离心分离细胞质上清液（S）和膜丸（P）。GRP78，细胞器颗粒标记；微管蛋白，细胞质标志物。**（E）**用100 ng/ml TNFα加1μg/ml放线菌素D或250ng/ml FasL治疗原发性或TAg MEF 4小时，并按C组所述进行分析。**（F）**标签-WT和标签-PACS-2^-/-MEF用载体（DMSO）或1μM PI-103预处理或不预处理1小时，然后用50 ng/ml TRAIL处理指定时间，并按面板C所述进行分析。

**图4。Akt磷酸化PACS-2 Ser₄₃₇体外和体内**
**（A）**PACS-2图显示N个-t吨终端区（NTR），货物-b条编结第页egion（FBR），其中包含Ser₄₃，的米支索第页egion（MR），包含Ser₂₄₄，序列号₄₃₅和Ser₄₃₇和C-t吨终端第页区域（CTR）。**（B）**指示的GST融合蛋白与[γ-³²P] -ATP和组成活性HA-Akt（WT）或激酶读取HA-Akt（KD）。Con，模拟感染细胞的免疫隔离。左侧放射自显影；赖特，输入。**（C）**指示的GST融合蛋白与[γ-³²P] -ATP和免疫隔离HA-Akt，如面板B所述。顶部，放射自显影术；底部，输入。**（D）**通过质谱法评估HA-标记的PACS-2凝胶内限制性胰蛋白酶消化的肽作为候选磷酸肽。[M+2H]=450.7的磷酸肽，对应于PACS-2胰蛋白酶肽RSTpS₄₃₇用纳米LC-MS/MS鉴定了一种磷酸化的LKER。**（E）** 左侧; 来自WT和PACS-2的脑细胞溶质^-/-用亲和纯化的抗PACS-2（Ab 832）孵育小鼠，并用抗PACS-1（Ab 193）或单克隆抗体81对免疫沉淀蛋白进行western blot分析，以检测pSer₄₃₇.赖特; 如上所述，对WT小鼠的肝脏和小肠胞浆进行分析。**（F）**WT和Akt1的裂解物^-/-按照面板E所述分析MEF以检测pSer₄₃₇.（G）HCT116细胞在增殖期采集（未经处理），血清饥饿16小时（饥饿），饥饿并用20%血清喂养3小时（对照），或饥饿并用1μM PI-103、20 nM RAD011、1μM BKM-120或20 nM BEZ-235预处理1小时，然后用20%血清再喂养3小时。通过western blot分析细胞以检测总PACS-2和PACS-2 pSer₄₃₇.pSer₄₃₇：计算PACS-2总比率，并将其归一化为未处理样本。数据表示为平均值+/-SD。

**图5。14-3-3蛋白结合PACS-2磷酸化-Ser₄₃₇**
**（A）**PACS-2从大鼠脑细胞液中免疫沉淀，western blot检测共沉淀14-3-3。**（B）**所示GST融合蛋白与ATP和组成活性HA-Akt（WT）或激酶缺失HA-Akt（KD）孵育，然后与14-3-3σ-his孵育₆用谷胱甘肽-硫糖捕获蛋白质复合物并结合14-3-3σ-his₆western blot检测。**（C）**（TMR）标记的含有pSer的16肽₂₅₉-Raf，PACS-2系列₂₄₄-PACS-2，pSer公司₂₄₄-PACS-2，序列号₄₃₇-PACS-2或pSer₄₃₇-随着GST-14-3-3γ浓度的增加，PACS-2（1 nM）培养三次。记录荧光偏振信号并用于计算K_d日第条。**（D）**14-3-3同种型与（TMR）标记的pSer一起孵育₄₃₇-PACS-2或pSer₂₅₉-Raf肽并按照面板C所述进行分析。计算K_d日显示值。

**图6。14-3-3调节PACS-2 Ser的凋亡活性₄₃₇**
**（A）**表达HA标记的PACS-2和myc标记的14-3-3ζ的HCT116细胞用25 ng/ml TRAIL处理指定时间。免疫印迹PACS-2ha免疫沉淀物以检测共沉淀14-3-3ζ和pSer₄₃₇.（B）标签PACS-2^-/-用eYFP标记的caspase-3报告子与pcDNA3.1（载体）或表达HA标记的PACS-2或PACS-2S的质粒共同转染细胞₄₃₇A单独或带有14-3-3ζ-myc。顶部：用10 ng/ml小鼠TRAIL处理16小时的细胞被固定，并分析表明caspase-3激活的核eYFP阳性细胞的数量。数据表示为平均+/-SEM。底部：量化数据的代表性免疫荧光图像。插入，14-3-3ζ-myc和HA标记的PACS-2或PACS-2S的共同表达₄₃₇A.比例尺，20μm。**（C）**标签PACS-2^-/-用western blot检测B中描述的细胞裂解、PACS-2免疫沉淀和共沉淀14-3-3ζ-myc。

**图7。PACS-2系列₄₃₇和14-3-3整合膜交通与凋亡Bid作用**
**（A）**用myc-TRPP2和空载体或HA-标记的PACS-2或PACS-2S对HeLa细胞进行核感染（Amaxa）₄₃₇A.36小时后，使用抗myc（mAb 9E10，绿色）和抗Golgin-97（红色）对细胞进行固定和共聚焦显微镜处理，并使用Alexa结合的二级抗体进行可视化。赖特：形态分析。误差条代表平均+/-SEM。比例尺，20μm。**（B）**用20 ng/ml TRAIL处理表达myc-TRPP2的HeLa细胞4小时，并进行共聚焦显微镜检查。Mitotracker（伪蓝色）、anti-myc（绿色）和anti-Golgin-97（红色）如图所示。*，凋亡细胞显示点状myc-TRPP2和线粒体塌陷。箭头，myc-TRPP2和Golgin-97重叠。比例尺，20μm。**（C）**MCF-7:Bid-GFP细胞用pcDNA3.1（载体）或表达HA标记的PACS-2或PACS-2S的质粒核转染（Amaxa）₄₃₇A单独或带有14-3-3ζ-myc。然后用载体或20 ng/ml TRAIL处理细胞4小时。左侧：在随机区域（最少300个细胞）中，含有Bid-GFP的细胞转位到线粒体（有丝分裂跟踪器，红色）的百分比被量化。数据表示为平均值+/-SD。赖特：MCF-7的免疫荧光：表达所示蛋白质并用TRAIL处理或不处理的Bid-GFP。插入，14-3-3ζ-myc与HA-标记的PACS-2或PACS-2S共同表达₄₃₇A.比例尺，20μm。

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