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.2009年8月；20(15):3525-32.
doi:10.1091/mbc.e09-03-0252。 Epub 2009年5月28日。

线粒体膜融合中丝裂霉素和OPA1介导的顺序步骤

知音歌 1, 玛丽亚姆·古哈尼, J迈克尔·麦卡弗里, 特伦斯·G·弗雷, 陈大卫
附属公司

线粒体膜融合中丝裂霉素和OPA1介导的顺序步骤

知音歌等。 分子生物学细胞. 2009年8月.

摘要

线粒体融合需要内外膜的协调融合。三种大型GT酶——OPA1和有丝分裂素Mfn1和Mfn2——对哺乳动物线粒体的融合至关重要。OPA1在显性视神经萎缩（视神经退行性疾病）中发生突变。在酵母中，体外内膜融合需要OPA1同源物Mgm1；然而，缺乏Mgm1的酵母在体内既没有外膜融合，也没有内膜融合，因为这两个过程紧密耦合。我们发现，在体内OPA1缺失的小鼠细胞中可以很容易地观察到外膜融合，但这些事件不会发展到内膜融合。在缺乏禁令的细胞中也发现了类似的缺陷，这是OPA1正确处理所必需的。相反，双Mfn-null细胞既没有外膜融合也没有内膜融合。OPA1全细胞中的线粒体通常包含由单个外膜结合在一起的多个基质室，这与外膜与内膜融合的解耦一致。此外，与丝裂原融合蛋白和酵母Mgm1不同，相邻线粒体不需要OPA1来介导膜融合。这些结果表明，与酵母中的情况相比，哺乳动物有丝分裂素和OPA1介导了不同的序列融合步骤，这些步骤很容易解偶联。

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数字

图1。
图1。
线粒体融合对丝裂原融合蛋白和OPA1的不同要求。（A） 通过融合右侧所示的亲本细胞进行的三种PEG细胞杂交融合分析的代表性图像。在底部的两个面板中，突变细胞（Mfn-null或OPA1-null）表达mito-DsRed，而野生型细胞（WT）表达mito-EGFP。在底部面板中，野生型和OPA1全细胞之间的细胞杂交显示绿色（左侧面板）和红色（中间面板）荧光团的广泛混合。箭头表示细胞杂种中含有DsRed的一些细长线粒体小管。（B） 聚乙二醇细胞杂交实验的定量。误差线表示3个独立实验的标准偏差，其中100个细胞杂交体得分。通过估算显示荧光团共定位的线粒体百分比对细胞杂种进行评分。完全融合表明细胞杂交中的所有线粒体都含有两个荧光团。带有融合和未融合线粒体的细胞杂种被记为部分融合。没有双重染色线粒体的杂交后代被认为没有融合。
图2。
图2。
不同OPA1亚型亲本细胞杂种的线粒体融合。在野生型细胞、OPA1非完整细胞或表达所示OPA1亚型的OPA1-完整细胞之间的细胞杂交中测量线粒体融合。误差条表示3个实验的SD。
图3。
图3。
OPA1-全细胞的外膜融合。（A） 三种PEG细胞杂交融合检测的代表性图像，通过融合右侧所示的亲本细胞并在细胞融合后1小时分析细胞来完成。用mCherry-OMP25监测线粒体外膜混合。在底部面板中，OPA1全细胞杂交显示绿色（左侧面板）和红色（中间面板）荧光团的部分混合。大插页是小盒子的放大图像。箭头突出显示插图中的单个线粒体。（B） 聚乙二醇细胞杂交实验的定量。按照图1B进行评分和定量，但由于细胞在1小时时仅表现出部分线粒体融合，因此部分融合类别被进一步分为多个细胞，其中大于或小于50%的线粒体表现出荧光团混合。误差条表示3个实验的SD。
图4。
图4。
Mfn-null和OPA1-null细胞中基质和外膜标记物的行为。通过分别测量Mfn-null（A和D）和OPA1-null（B和E）细胞中基质标记物mito-PA-GFP-OMP25（D–F）的稀释度来监测完全融合和外膜融合。面板A、B、D和E显示了整个20分钟记录过程中每20秒10个线粒体的个体标准化荧光痕迹。在少数记录道中，不连续性可归因于记录过程中的短暂散焦。对A和B中的数据进行平均，得出C中的痕量。对D和E中的数据求平均，得出F中的微量。在E和F中，与Mfn-null细胞相比，来自OPA1-null细胞的线粒体的PA-GFP-OMP25荧光下降幅度更大。使用来自野生型细胞中6个线粒体的数据来获得C中的野生型平均值；使用来自5个线粒体的数据获得F的野生型平均值。F的图例显示在C中。
图5。
图5。
OPA1-null细胞外膜融合事件的可视化。（A） OPA1-null细胞中一对线粒体中的PA-GFP荧光示踪（表达PA-GFP-OMP25和mito-DsRed）。线粒体b条是光激活的，最初含有高水平的PA-GFP荧光。线粒体一未经光活化，因此最初未显示PA-GFP荧光。在第2帧中，PA-GFP荧光逐步下降b条与之相匹配的是增加荧光一。与这些更改相对应的静止帧显示在右侧。荧光变化前后的帧显示为合并图像（顶部）、绿色图像（中部）或红色图像（底部）。标记参与每个外膜融合事件的相关线粒体。虽然发生了PA-GFP荧光交换，但DsRed没有转移。在我们的PA-GFP光活化条件下，DsRed被光漂白。因此，高GFP荧光和无DsRed荧光很容易观察到光激活线粒体。（B） 另一个类似于A的例子。显示的静止帧来自电影S1和S2。
图6。
图6。
EM断层扫描显示OPA1缺失线粒体中的多个基质。（A和B）传统薄片的电子显微照片显示，A中右下角的线粒体和B中左下角的线粒体中似乎包含多个基质区室。（C和D）根据分段电子断层图计算的三维模型视图。两者都显示线粒体至少有两个单独的基质室。外层膜呈半透明蓝色。（C）中的线粒体包含一个大的基质室，由一个呈白色的内界膜包围，其中一个大嵴呈红色，一个小嵴呈黄色，另外三个单独的膜室呈红色、洋红和绿色，与本节内的内界薄膜不相连；一个较小的单独矩阵隔间在顶部呈现为绿松石色。D中的线粒体包含一个较小的基质室，底部呈绿松石色，较大的基质室呈白色。后者包含另一个由红色和黄色的双层膜包围的大隔间。
图7。
图7。
Phb1敲除细胞中的解偶联外膜融合。Mito-DsRed和PA-GFP-OMP25在含有Phb1 shRNAi的野生型MEF中表达。在左侧面板中，线粒体一含有高水平的PA-GFP荧光，靠近线粒体b条，含有DsRed荧光，但很少有PA-GFP荧光。30秒后，在右侧面板中，PA-GFP荧光一已转入b条不交换DsRed。
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