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.2009年6月15日；15(12):4114-22.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-09-0005。 Epub 2009年5月26日。

苯甲基咪唑降低胰腺癌和黑色素瘤中Toll样受体3和非经典Wnt5a的表达以及肿瘤细胞的生长和迁移

安东尼·施瓦茨 1, 拉米罗·马尔戈, 艾利克·迪克森, 阿沙尼·T·维拉拉特纳, 安德烈·斯洛敏斯基（Andrzej Slominski）, 雅各布·沃茨曼, 诺里卡祖·哈里, 艾美·D·科恩, Randall T Moon公司, 弗兰克·L·施瓦茨, 道格拉斯·J·戈茨, 伦纳德·D·科恩, 凯利·D·麦考尔
附属公司

苯甲基咪唑降低胰腺癌和黑色素瘤中Toll样受体3和非经典Wnt5a的表达以及肿瘤细胞的生长和迁移

安东尼·施瓦茨等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：评估（a）胰腺癌和恶性黑色素瘤细胞中Wnt5a的表达是否与Toll样受体3（TLR3）和/或TLR3信号的组成水平有关；（b） 苯甲基咪唑（C10）是一种新型TLR信号抑制剂，可降低构成性Wnt5a和TLR3水平，并可促进细胞生长和迁移；以及（c）C10作为胰腺癌和恶性黑色素瘤细胞体内生长的潜在抑制剂的疗效。

实验设计：我们使用了多种分子生物学技术，包括但不限于PCR、Western blotting和ELISA来评估组成性激活TLR3/Wnt5a表达和信号的存在。分别采用基于3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物的技术和划痕试验来评估细胞生长和迁移的抑制。使用小干扰RNA技术证实TLR3对细胞生长的调节。将裸鼠和重度联合免疫缺陷小鼠植入人胰腺癌和/或黑色素瘤细胞，并评估C10对肿瘤生长的影响。

结果：我们表明，在人类胰腺癌和恶性黑色素瘤细胞系中，组成性TLR3表达与组成性Wnt5a相关，C10可以降低组成性TLR-3/Wnt5a的表达和信号传递，表明它们是相互关联的信号系统，C10抑制这两种癌细胞系的生长和迁移。我们还报告说，C10在裸鼠或严重联合免疫缺陷小鼠体内可有效抑制人类胰腺癌和恶性黑色素瘤的生长，并与抑制信号转导器和转录激活剂3的激活有关。

结论：C10可能对胰腺癌和恶性黑色素瘤具有潜在的治疗适用性。

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数字

图1
图1。TLR3、Wnt5a、IFN-β和CXCL10在人胰腺和黑色素瘤细胞中组成性表达，TLR3具有功能
（A）通过半定量RT-PCR测定PANC-1、BXPC-3胰腺癌、C32、UACC647、UACC1273EV、M93-047和HTB-137黑色素瘤细胞以及ARO和WRO甲状腺癌细胞中TLR3和Wnt5a的相对mRNA水平。（B）通过半定量RT-PCR测定PANC-1、M93-047和HEK 293细胞中IFN-β和CXCL10的mRNA水平。（A和B）使用ImageGauge 3.12软件对RT-PCR的条带进行量化，数据表示为相对基因表达水平，该水平与内部控制基因β-肌动蛋白相对应。（C）用poly I:C处理可激活PANC-1细胞中NF-κB和IFN-β基因的表达。用100 ng荧光素酶报告质粒pNF-kB-Luc或pIFN-βLuc和2 ng内对照质粒phRL-Tk瞬时转染PANC-1细胞。转染24小时后，细胞与poly I:C（100µg/ml）或poly I:C以及0.25%二甲基亚砜或0.5 mM C10孵育6小时。误差条表示标准偏差。*代表P<0.05和+如图所示，两组之间的显著差异为P＜0.001。
图2
图2。C10降低人类胰腺癌和黑色素瘤细胞中构成性TLR3、Wnt5a、CXCL10、IFNβ和IL-6 RNA以及IL-6蛋白水平
用0.25%二甲基亚砜或0.5 mM C10处理PANC-1和M93-047细胞24小时。实时PCR评估TLR3、Wnt5a、CXCL10、IFN-β和IL-6 RNA水平（A-D），IL-6特异性ELISA评估IL-6蛋白水平（D）。如图所示，各组之间的*和+显示出显著差异（*P<0.05和+P<0.000001）。
图3
图3。C10抑制人胰腺癌和黑色素瘤细胞的增殖和迁移
细胞增殖（A）和迁移（B）在用0.25%二甲基亚砜或0.5 mM C10进行24小时处理后，对其进行测量。误差线表示标准偏差，*表示各组之间的显著差异（P<0.00001）。
图4
图4。TLR3 siRNA抑制PANC-1细胞生长
用抗人TLR3、TLR4或对照“打乱”序列的siRNA稳定转染PANC-1细胞。然后将表达针对人类TLR3、TLR4和干扰序列的siRNA的PANC-1细胞的细胞生长速率与PANC-1的细胞生长率进行比较。数据表示为与对照PANC-1细胞相比的细胞生长百分比。误差线表示标准偏差，*表示各组之间的显著差异（P=0.02）。
图5
图5。C10抑制人胰腺癌和黑色素瘤细胞中构成性和IL-6诱导的STAT3磷酸化
在（A和B）用0.25%二甲基亚砜或0.5 mM C10处理PANC-1和M93-047细胞6小时。然后提取核蛋白，组成型磷酸-STAT3Tyr705型和磷酸-STAT3727系列采用西方分析方法进行分析。在（C&D）PANC-1和M93-047细胞在含有或不含0.25%二甲基亚砜或0.5 mM C10的情况下预处理1小时，然后用20 ng/ml人IL-6处理或不处理10分钟。然后提取核蛋白并磷酸化-STAT3泰尔705和磷酸-STAT3序列727通过西方分析进行评估。
图6
图6。C10抑制胰腺癌裸鼠模型和人黑色素瘤裸鼠和SCID小鼠模型中的肿瘤生长
胰腺癌裸鼠模型中的每只小鼠注射500000个PANC-1细胞，黑色素瘤实验中的每一只裸鼠和SCID小鼠接受1×106黑色素瘤细胞。细胞置于颈部后皮下。然后，在胰腺癌实验中对小鼠进行50天的不治疗或10%二甲基亚砜、C10或“模拟”注射治疗，或在黑素瘤实验中进行2周的治疗，如图所示。“模拟”注射=插入类似的注射器针头。(A类)C10在很大程度上阻止了肿瘤的形成并降低了磷酸化STAT3泰尔705C10处理动物的水平。使用ImageGauge 3.12软件对来自西方分析的条带进行量化，数据表示为相对基因表达水平，该水平根据内部控制基因β-Actin进行标准化。N=每组12只小鼠。（B）将上述人类黑色素瘤细胞注射到裸鼠体内，并按指示进行治疗。数据表示为平均肿瘤重量，并且还描述了每个组的代表性肿瘤。（C）SCID小鼠在注射后2周注射人黑色素瘤细胞。在任何小鼠中都没有观察到皮毛结构和/或外观的异常变化，如（a）组中的小鼠所示，该小鼠有一个大的对照肿瘤，但仍处于活动状态，并且没有恶病质。（b）、（d）和（f）中所示的小鼠在肿瘤切除之前，其外衣用酒精浸透，以便更好地观察肿瘤。面板（c）、（e）和（g）分别是从面板（b）、（d）和（f）中的小鼠身上切除的肿瘤。面板（h）显示了每组SCID小鼠的平均肿瘤质量。误差线代表标准偏差，*和+显示未治疗组和C10治疗组之间的显著差异（*P<0.05和+P<0.01）。
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