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。2009年6月1日；185(5):889-902.
doi:10.1083/jcb.200807066。 Epub 2009年5月25日。

核糖体出口通道内的跨膜片段触发对Sec61p转座子酶的RAMP4募集

Martin R泳池 1
附属公司

核糖体出口通道内的跨膜片段触发对Sec61p转座子酶的RAMP4募集

Martin R泳池。 J细胞生物学。 。

摘要

膜蛋白整合主要发生在内质网，由Sec61p复合物形成的转座子介导。转座子在多肽出口位置与核糖体结合，以协同翻译的方式进行整合。核糖体蛋白Rpl17的定位使其与核糖体出口通道和出口部位附近的核糖体表面接触，在出口部位与转座子密切相关。核糖体出口通道内存在跨膜（TM）片段导致RAMP4在Rpl17附近的位置向转座子募集。这表明Rpl17具有信号传递功能，可以识别核糖体内的TM片段并触发转座子的重排，从而启动后续TM片段的整合。

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数字

图1。
图1。
膜成分保护Rpl17免受蛋白水解消化。（A） 用增加浓度的V8蛋白酶处理游离核糖体和RMs，并用SDS-PAGE和Rpl17免疫印迹分析N-trm公司、Rpl18和Rpl23a抗体。图中显示了缺乏C末端（Rpl17ΔC）的稳定Rpl17降解产物的位置。抗体与另一核糖体蛋白（*）发生弱交叉反应。（B） 用2%洋地黄素溶解RM，用V8蛋白酶对膜进行有限消化，并按照A中所述进行分析。以相同的方式处理模拟处理的样品（−洋地黄），但不存在洋地黄。
图2。
图2。
交叉链接显示Rpl17与膜组分相邻。（A） 用二甲基亚砜或交联剂DFDNB（25µM）、DSG（200µM。通过SDS-PAGE和Rpl17免疫印迹分析反应C-trm公司抗体。标记了与近似指示尺寸加合物的主要交联。MBS还可重复观察到额外的弱7-kD交联加合物（o）。（B）用200µM MBS处理RM以诱导交联。用1 M LiCl处理微粒体，从rRNA中提取核糖体蛋白，并通过Nycodenz梯度浮选从核糖体残余物中分离。通过TCA沉淀回收漂浮物和非漂浮物，并通过SDS-PAGE和Rpl17免疫印迹分析C-trm公司抗体。为了控制微粒体的完全漂浮，还使用抗SRβ（一种完整的内质网膜蛋白）抗体来检测印迹。
图3。
图3。
Rpl17可交联至Sec61β。（A） RMs（900 eq）用200µM MBS交联。用洋地黄素溶解后，核糖体被重新分离，用氯化锂提取核糖体蛋白，提取物用抗Rpl17免疫沉淀C-trm公司抗体。结合蛋白用SDS洗脱，SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。在没有微粒体提取物的情况下进行模拟免疫沉淀，以识别抗血清产生的条带。将21 kD（*）处的显著带和30 kD带一起切除，该带是MBS处理的RM中的LiCl提取物所特有的(♦) 凝胶内胰蛋白酶消化后进行质谱分析。M、 分子量标记。（B） 如上所述，使用抗Rpl17抗体进行交联反应的变性免疫沉淀（IP）（100当量RM）C-trm公司或抗Sec61β抗血清。样品通过SDS-PAGE和Rpl17免疫印迹分析C-trm公司抗血清（左）或Sec61β抗血清（右）。指示IgG重链（hc）和轻链（lc）的位置。白线表示中间车道已拼接。
图4。
图4。
膜溶解后，Sec61β和Rpl17保持接近。将RM重新悬浮在增溶缓冲液中，并用2%洋地黄素增溶。MBS或DSG均可诱导交联。通过SDS-PAGE和Sec61β抗血清免疫印迹分析反应。星号表示的两种主要交联物种仅存在于完整的膜中，并在洗涤剂处理后消失。
图5。
图5。
pPV集成中间体的生成和纯化。（A） pPV融合蛋白的示意图，由pPL的N末端组成，包括信号序列（SS），融合到VSV-G的TM结构域（TMD）片段和C末端细胞溶质结构域，在EKRM和纯化的SRP存在的情况下，在兔网织红细胞裂解液中翻译出缺少终止密码子以及带有完整终止密码子的全长pPV（pPV116STOP）。如有指示，用嘌呤霉素处理反应，从核糖体中释放新生链。样品通过SDS-PAGE和磷光成像进行沉淀和分析。显示了未处理的pPL/pPV（*）和信号序列处理的PL/PV（•）形式。（C） 在有指示的地方，插入反应是用缺乏终止密码子的指定长度的pPV mRNA编程的。使用环己酰亚胺稳定产生的转位中间体，并将其调整为500 mM KOAc。通过HS Nycodenz梯度通过浮选将膜重新分离，并收集漂浮（F）和未漂浮（U）部分。通过SDS-PAGE和Rpl17免疫印迹分析组分N-转/分和Sec61β抗血清。
图6。
图6。
pPV集成中间体中Rpl17的交联。（A） 使用定义的新生链（nc）长度的pPV mRNA进行插入反应。作为对照，还进行了缺乏外源mRNA的模拟插入反应（−）。在通过SDS-PAGE和Rpl17免疫印迹分析之前，通过HS梯度（如图5C所示）通过浮选纯化得到的整合中间体，并用200µM MBS处理C-trm公司（B）使用pPL86或110mer在A中生成易位中间体，并使用MBS进行纯化和处理。（C）使用pPV突变株生成易位中介体，并用MBS处理，其中TM片段中的七个疏水残基突变为极性残基，如所示（^）。（D） 用DMSO（−）或200µM MBS处理RM，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析Rpl17C-trm公司长时间暴露于免疫印迹显示，除了两种Sec61β交联产物外，还有两种较弱的交联产物，分别为～6和～7 kD。白线表示中间车道已拼接。
图7。
图7。
TM片段的存在导致Rpl17和RAMP4之间的差异交联。（A） 在与200µM MBS交联之前，对RMs进行模拟处理或用25 mM EDTA处理。在相同的SDS-PAGE凝胶上分离反应并对Rpl17进行免疫印迹C-trm公司RAMP4和Sec61β。图中显示了Rpl17-Sec61β交联的位置（*）以及7-kD Rpl17交联，其与20-kD RAMP4交联相结合（>）。（B） 使用抗Rpl17抗体进行交联反应的变性免疫沉淀（IP）（100当量RM）C-trm公司或抗RAMP4抗血清。使用抗RAMP4或抗Rpl17通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品C-trm公司抗体。总粒径和免疫沉淀粒径均来自同一凝胶，暴露时间分别为30 s和3 min。27-kD Rpl17-RAMP4交联产物的位置如（o）所示。（C） 如图6 A所示，产生、纯化并用MBS处理具有确定的新生链（nc）长度（残基）的pPV易位中间产物。通过SDS-PAGE和RAMP4抗血清的免疫印迹分析反应。再次显示27-kD Rpl17-RAMP4交联产物，并显示出对pPV新生链长度的强烈依赖性。印迹上的数值以千道尔顿为单位。白线表示中间车道已拼接。
图8。
图8。
RAMP4被招募到核糖体-转座子复合物中。（A） 用洋地黄素溶解RM并通过蔗糖垫离心，得到含有RAMP的核糖体颗粒。用Rpl17、Sec61β和RAMP4抗血清通过SDS-PAGE和免疫印迹分析等量的总组分和RAMP组分。（B） 如图4所示，在洋地黄素治疗前后，微粒体与MBS交联。用Rpl17免疫印迹法分析反应C-trm公司抗血清。27-kD Rpl17xRAMP4交联物种的位置如（o）所示。印迹值以千道尔顿为单位显示。（C） 如图6 A所示，生成并纯化链长为87和94的pPV易位中间产物，并用洋地黄素溶解，制备如A中所示的RAMP部分。通过Rpl17、Sec61β、，和RAMP4抗血清。
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