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.2009年7月；51（1）：176-86。
doi:10.1016/j.jhep.2009.03.021。 Epub 2009年5月3日。

在喂食脂肪生成性甲基缺乏饮食的小鼠中，肝脏表观遗传表型预先决定了个体对肝脏脂肪变性的易感性

伊戈尔·波格里布尼 1, Volodymyr P Tryndyak公司, Tetyana V Bagnyukova号, 斯蒂芬·梅尼克, 贝弗利·蒙哥马利, 莎伦·罗斯, 约翰·R·拉特德斯, 伊凡·鲁辛, 弗雷德里克·贝兰德
附属公司

肝脏表观遗传学表型预先决定了喂食脂肪性甲基缺乏饮食的小鼠对肝脏脂肪变性的个体易感性

伊戈尔·波格里布尼等。 肝脏病学杂志. 2009年7月.

摘要

背景/目的：表观遗传变化在疾病的病因和发病机制中的重要性日益得到认识。然而，表观遗传学改变在肝脂肪变性发生中的作用以及个体对这种病理状态易感性的原因基本上尚不清楚。

方法：雄性近交系C57BL/6J和DBA/2J小鼠被喂食产生脂肪的甲基缺乏性饮食（MDD），这种饮食会导致类似于人类非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的肝脏损伤，持续6、12或18周，并观察整体和重复元素胞嘧啶甲基化、组蛋白修饰、，并测定了肝脏中负责这些表观遗传修饰的蛋白质的表达。

结果：近交系C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏脂肪变性的发展伴随着显著的表观遗传异常。基因组和重复序列胞嘧啶甲基化明显缺失，尤其是在大卫星和小卫星，伴随着重复相关转录物水平的增加、组蛋白异常修饰和维持DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达的改变，证明了这一点以及两种小鼠品系肝脏中的从头DNMT3A蛋白。然而，与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠的特征是，最初的重复元素甲基化程度较低，正常肝脏中组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）和H3赖胺酸27（H3K27）三甲基化程度也较低，因此出现了更显著的NASH特异性病理形态学变化。

结论：这些结果在机制上将表观遗传学改变与肝脂肪变性的发病机制联系起来，并强烈提示细胞表观遗传学状态的差异可能是个体对肝脂肪变性易感性的预先决定因素。

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数字

图1
图1。连续18周喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏的组织形态学变化（A）和甘油三酯浓度（B）
（A）对照组C57BL/6J的正常肝脏（一）和DBA/2J（二）老鼠。甲基缺乏型C57BL/6J肝脏的代表性组织病理学变化（三、四）和DBA/2J（四、六）老鼠。弥漫性大囊性脂肪变性，4级，C57BL/6J(三)DBA/2J中5级（四）老鼠。甲基缺乏型DBA/2J小鼠肝脏小叶中心区的典型变化（六）耗尽（坏死）的肝细胞被纤维化（短箭头）、炎症（箭头）和卵圆细胞增殖（长箭头）所取代。注意肝细胞的巨细胞增生症（核细胞）（*）。甲基缺乏C57BL/6J小鼠的肝脏中观察到类似但较轻的损伤（五）.（三）和（四）.原稿放大50倍；（一）,（二）,（五）、和（六）–原稿放大200倍。c-小叶中心区，p-门脉周围区，L-脂质空泡。相对于同一时间点的对照，肝甘油三酯浓度以平均值±标准偏差（n=5）表示。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著。
图2
图2。喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中的总DNA甲基化水平
对照组小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）的肝脏中的DNA甲基化状态通过以下方法进行评估：[三H] 用甲基化敏感限制性内切酶HpaII消化基因组DNA后进行的dCTP延伸试验，当两条链上的内胞嘧啶残基未甲基化时，该酶会裂解CCGG序列。范围[三H] dCTP掺入量与非甲基化CpG位点的数量成正比。数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著。
图3
图3。喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中的蛋氨酸（A）、SAM（B）、SAH（C）和SAM/SAH比率（D）水平
数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著；c（c）-与对照C57BL/6J小鼠显著不同。
图4
图4。喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中重复元素的DNA甲基化水平
按照“材料和方法”中的详细说明，使用甲基化敏感McrBC-qPCR分析评估了对照小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）肝脏中主要和次要卫星、IAP、LINE和SINE元素的DNA甲基化状态。McrBC是一种甲基化特异性核酸内切酶，与甲基化敏感的限制性内切酶相反，它可以裂解单链或双链上含有5-甲基肌氨酸残基的DNA，但不会作用于非甲基化DNA。因此，PCR产物回收率更高，C值更低t吨用McrBC对DNA进行预处理后，该值表示低甲基化。数据以同一时间点相对于对照的平均值±标准差（n=5）表示。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著；c（c）-与对照C57BL/6J小鼠显著不同。
图5
图5。主要和次要相关转录物的表达Cpt1a型喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中的基因
主要和次要相关转录物的表达水平Cpt1a型用qRT-PCR检测基因。结果显示为主要和次要相关转录物的折叠变化Cpt1a型在正常化后的同一时间点，喂食甲基缺乏饮食（黑条）的小鼠与对照小鼠（灰条）的肝脏中的基因Gapdh公司（平均值±S.D.，n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著。
图6
图6。喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏组蛋白修饰的Western blot分析
从对照小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）的肝脏中分离出总组蛋白的酸提取物，通过SDS-PAGE分离，并使用针对组蛋白macroH2A和H3K9me3、H3K27me3和组蛋白H4K20me3的特定抗体进行免疫印迹。使用ECF底物进行Western Blotting化学荧光检测（GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ），并使用Storm Imaging System（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）直接测量。用ImageQuant软件（分子动力学）分析信号强度。在两个独立的实验中重现了这些结果。（A）组蛋白macroH2A水平；（B）H3K9me3水平；（C）H3K27me3水平；（D）H4K20me3的液位。数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。一-在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著；c（c）-与对照C57BL/6J小鼠显著不同。
图7
图7。喂食甲基缺乏饮食18周的C57BL/6J DBA/2J和年龄匹配的对照小鼠肝脏中负责DNA和组蛋白赖氨酸甲基化的蛋白质的蛋白质印迹分析
通过SDS-PAGE分离来自对照小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）肝脏的肝组织裂解物，并使用针对DNMT1、DNMT3A、甲基-CpG-结合蛋白MeCP2和KMTs Suv39h1、Suv4-20h2和RIZ1的特异性抗体进行Western免疫印迹。通过对β-肌动蛋白的免疫染色证实了样品装载量相等。在两个独立的实验中重现了这些结果。显示了典型的Western免疫印迹图像。如图5图例所示，对图像进行分析。数据表示为与年龄匹配的对照小鼠相关的平均值±S.D.（n=5）。每个时间点的控制值被视为100%。一。与同一时间点的控件显著不同。
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