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.2009年5月；5（5）：e1000434。
doi:10.1371/journal.ppat.1000434。 Epub 2009年5月15日。

溶组织内阿米巴脂肽磷酸聚糖激活的自然杀伤T细胞对控制阿米巴肝脓肿至关重要

汉尼洛尔·洛特 1, 内斯托·冈萨雷斯-罗尔丹, 布科·林德纳, 弗洛里安·维诺, 阿曼多·伊西巴斯, 玛莎·莫雷诺-拉丰, 阿图尔·尤尔默, 奥托·霍尔斯特, 埃格伯特·坦尼奇, 托马斯·雅各布斯
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溶组织内阿米巴脂肽磷酸聚糖激活的自然杀伤T细胞对控制阿米巴肝脓肿至关重要

汉尼洛尔·洛特等。 公共科学图书馆-病理学. 2009年5月.

摘要

先天性免疫反应被认为在阿米巴肝脓肿（ALA）的控制中起着重要作用，ALA是一种由原生动物寄生虫溶组织内阿米巴感染引起的严重侵袭性阿米巴病。在该疾病的小鼠模型中，我们先前证明Jalpha18（-/-）小鼠缺乏不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，会出现更严重的脓肿。在这里，我们显示使用α-半乳糖神经酰胺（alpha-GalCer）特异性激活iNKT细胞可显著减小ALA损伤的大小，而CD1d（-/-）小鼠则出现更严重的脓肿。我们鉴定了一种来自溶组织杆菌膜的脂肽磷酸聚糖（EhLPPG）可能是NKT细胞的天然配体，并表明该分子的纯化磷脂酰肌醇（PI）部分诱导NKT淋巴细胞产生保护性IFN-γ，但不诱导产生IL-4。负责NKT细胞活化的EhLPPG的主要成分是二酰化PI，（1-O-[（28:0）-溶血磷脂酰-3-磷脂酰-]2-O-（C16:0）-Ins）。NKT细胞产生IFN-gamma需要CD1d的存在，同时通过MyD88和IL-12分泌TLR受体信号。与α-GalCer应用类似，EhLPPG治疗显著降低阿米巴感染小鼠ALA的严重程度。我们的结果表明，EhLPPG是一种阿米巴分子，对限制ALA的发展很重要，并可能解释为什么大多数溶血性大肠杆菌感染的个体没有发展成阿米巴肝脓肿。

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数字

图1
图1。NKT细胞在小鼠ALA控制中的作用。
用α-GalCer治疗的小鼠或缺乏CD1d（CD1d）的小鼠−/−)肝内感染了毒株溶组织内阿米巴滋养体。处死7天p.i.动物，并测定肝脓肿的大小。条形图表示脓肿评分相对于野生型对照小鼠（WT）的大小。结果来自3个独立实验，每个实验包含5到7只动物（统计数据：Mann-Whitney U检验）。
图2
图2。EhLLPG从溶组织杆菌滋养体刺激脾细胞和肝淋巴细胞产生IFN-γ，但不刺激IL-4。
（A） EhLPPG通过12%SDS-PAGE分离，并通过以下染色程序进行培养：胶体考马斯染色（第2道）、周期性酸-雪夫染色（第3道）、改良硝酸银染色（第4道）和用mAb EH5培养的EhLPPG Western blot（第5道）。低分子量蛋白质标准物（BioRad），用胶体考马斯染色，如第1道所示。通道2的阴性染色显示了主要蛋白质含量的消失，通道3和4的阳性染色证明了分子的高糖基化，通道5的EH5检测证明了溶组织内阿米巴LPPG。（B、C）APC（1x105)在与脾淋巴细胞或梯度分离的肝淋巴细胞（4x10）共培养之前，用2µgα-GalCer或EhLPPG脉冲处理3小时5). 48小时后取上清，通过ELISA（C）检测IFN-γ（B）和IL-4的存在。与DMSO对照组相比，产生IFN-γ*(对<0.05);**(对<0.005),***(对<0.001); 曼·惠特尼U检验。结果是通过重复至少5次的实验得出的。
图3
图3。EhLPPG PI部分的结构表征。
（A） 薄层色谱法。通道1，来自Sigma的PI，通道2显示了EhPI亚硝酸脱氨后获得的两种亚型EhPIa和EhPIb。（B） 用ESIFT-ICRMS分析EhPIs。EhPIa（上部）和EhPIb（下部）的负离子质谱。[M]-26对应于使用30∶1或28∶1脂肪酸时的交换。通过ESI-IRMPD进一步分析EhPI。（C） EhPIa和EhPIb中主要母离子的负离子质谱如（B）所示。
图4
图4。EhPI的结构和NKT细胞刺激能力。
（A） EhPIa（左）和EhPIb（右）的拟议结构。EhPIs之间的唯一区别是EhPIb中位置2的肌醇酰化。显示了脂肪酸和摩尔比。（B） α-GalCer、EhLPPG、EhPI、EhPIa和EhPIb脉冲的APC刺激NKT细胞产生IFNγ。干扰素-γ产生量与二甲基亚砜对照*(对<0.05);**(对<0.005); 阿诺瓦，邓内特。结果来自三个独立的实验。
图5
图5。CD1d通过EhLPPG和EhPI限制NKT细胞激活。
（A） APC（5x104)用2µgα-GalCer、EhLPPG或EhPI对WT小鼠进行脉冲处理，并用1x10孵育5Jα18脾细胞制剂中的淋巴细胞−/−缺乏我NKT细胞和CD1d−/−缺少老鼠我NKT和d日NKT细胞。用ELISA法检测IFN-γ分泌。EhLPPG/EhPI激活的WT脾细胞产生IFN-γ的差异*(对<0.05);**(对<0.005),***(对<0.001); 阿诺瓦，邓内特。（B） APC由WT或CD1d生成−/−小鼠，按照上述方法进行脉冲处理，并与Vα14转基因小鼠的梯度纯化肝淋巴细胞孵育。肝脏我通过磁性细胞分选进一步纯化NKT细胞。用ELISA法检测IFN-γ。EhLPPG/EhPI激活的WT脾细胞产生IFN-γ的差异*(对<0.05); 学生t测试。结果来自三个独立的实验。
图6
图6。EhLPPG激活NKT细胞涉及TLR信号通路的分子。
来自IL12-p40的APC−/−，MyD88型−/−、TRIF−/−（A） ，CD1d−/−，TLR2−/−, 4−/−, 9−/−（B） 和TLR1−/−, 2−/−和6−/−（C） 产生、用EhLPPG脉冲并用于刺激来自Vα14tg小鼠的纯化T细胞。用ELISA法测定纯化T细胞产生IFN-γ的能力。CD1d中EhLPPG依赖性NKT细胞激活被消除−/−，IL-12p40−/−、MyD88和TLR 2−/−和TLR 6−/−老鼠。结果来自两个独立的实验。
图7
图7。EhLPPG是内化的，需要加工或内吞以激活NKT细胞。
（A） WT APC用20µg/ml EhLPPG脉冲3小时，用4%PFA固定，并用0.5%皂苷透化；EhLPPG用单克隆抗体EH5标记，抗Lamp-1单克隆抗体用于共焦显微镜检测晚期内体。实验进行了四次。（B） 在用α-GalCer（4µg/ml）和EhLPPG（10µg）刺激NKT细胞后，用内吞抑制剂bafilomycin A1（10 nM，30 min）处理APC导致IFN-γ的生成减少，而用PamCys（4μg/ml）及LPS（1 ng/ml）则没有。向用α-GalCer和EhLPPG脉冲的APC中添加mAb EH5（100µg/ml），可特异性抑制共培养NKT细胞的IFN-γ分泌。
图8
图8。EhLPPG处理小鼠ALA的发育。
肝内毒性激发前24小时溶组织内阿米巴滋养体、WT小鼠经腹腔注射4µg EhLPPG。感染后7天，处死小鼠并测定脓肿大小。显示了与未经治疗的对照组相比，经EhLPPG治疗的小鼠中ALA的大小。结果来自两个独立实验，每个实验由5到6只动物组成（统计数据：Mann-Whitney U检验）。
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