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.2009年6月；49(6):2055-67.
doi:10.1002/hep.22890。

肝星状细胞表达功能性CXCR4：在基质细胞衍生因子-1α介导的星状细胞活化中的作用

冯红 1, 阿娜·图亚马, 李婷芳, 约翰尼·洛克, 里图·阿加瓦尔, 新城, 安妮塔·加格, M伊莎贝尔·菲埃尔, 迈伦·施瓦茨, 何塞·瓦卢斯基（Jose Walewski）, 安德里亚分行, 艾莉森·德·施克特, Meena B Bansal公司
附属公司

肝星状细胞表达功能性CXCR4：在基质细胞衍生因子-1α介导的星状细胞活化中的作用

冯红等。 肝病学. 2009年6月.

摘要

趋化因子与其受体的相互作用与肝星状细胞（HSC）的激活有关。丙型肝炎肝硬化患者CXCR4信使RNA的肝脏表达增加，其内源性配体基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）的血浆水平与这些患者的纤维化增加相关。CXCR4在HSC中的表达尚未见报道。因此，我们检测了HSC在体内和体外是否表达CXCR4，并探讨了SDF-1α/CXCR4受体参与是否促进HSC活化、纤维化和增殖。丙型肝炎肝硬化中CXCR4和SDF-1α的肝蛋白表达增加，免疫荧光和免疫组织化学染色证实HSC在体内表达CXCR4。永生人星状细胞和原代人HSC表达CXCR4，细胞表面受体表达随着培养诱导的逐渐激活而增加。用重组SDF-1α处理星状细胞可增加α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达，并刺激HSC增殖的剂量依赖性增加。抑制剂研究表明，SDF-1α/CXCR4依赖性细胞外信号调节激酶1/2和Akt磷酸化介导对I型胶原表达和星状细胞增殖的影响。

结论：HSC在体内和体外表达CXCR4受体。SDF-1α激活CXCR4受体通过其对HSC激活、纤维化和增殖的影响而促纤维化。细胞外信号调节激酶1/2和磷酸肌醇3-激酶途径介导SDF-1α诱导的对HSC I型胶原表达和增殖的影响。CXCR4小分子抑制剂的可用性使该受体成为抗纤维化方法的诱人靶点。

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图1
图1
肝脏CXCR4和SDF-1增加αHCV肝硬化患者的蛋白表达和体内星形细胞CXCR4的表达。（A） 比较CXCR4和SDF-1的表达α在HCV肝硬化肝和正常肝中，全肝匀浆是从接受HCV肝移植患者（n=7）的移植肝或无潜在肝病的患者（n=5）的正常肝组织边缘制备的。对50微克蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并在膜上探测CXCR4和SDF-1α. β-肌动蛋白被用作负荷控制。显示了每组三个样品的代表性蛋白质印迹。（B） 对所有样本进行密度测定，以比较归一化为β-肌动蛋白，并以图形表示。CXCR4的蛋白表达平均高1.8倍，SDF-1α蛋白质表达增加2.4倍(**P（P）<0.005）。（C） 为了确定活化的星状细胞是否在体内表达CXCR4，联合免疫抑制α-SMA（绿色）和CXCR4（红色）在三个移植HCV肝硬化肝脏的冰冻切片上进行。显示了具有代表性的图像（放大倍数×100）。箭头表示阳性星状细胞表达CXCR4和α-座椅模块组件。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染成细胞核蓝色。（D） HCV肝硬化肝上CXCR4的免疫组织化学证实，CXCR4+细胞具有星状细胞形态（黑色箭头）以及门管区内胆管上皮细胞（绿色箭头）和淋巴细胞（橙色箭头）的染色。显示了具有代表性的图像（放大倍数×200和×400）。
图2
图2
人类HSC表达CXCR4。（A） Western blot分析显示CXCR4蛋白在人HSC株（LX-2）和原代HSC中表达（第3代）。使用Jurkat T细胞裂解物作为阳性对照。（B） 原代HSC的免疫荧光染色显示CXCR4在细胞质和细胞表面的表达为红色。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色为蓝色。（C） 为了进一步检测人类HSC中的基线细胞表面和总CXCR4受体表达，对LX-2细胞进行了FACS分析。固定细胞（4%多聚甲醛）以检测细胞表面表达，固定和渗透细胞（4%的多聚甲醛和0.1%皂苷）以检测总受体表达，并在室温下与PE-免疫球蛋白G2a同型对照或PE-结合抗CXCR4孵育1小时。使用FACS仪器（FACScan，Becton Dickinson）对细胞进行洗涤和分析。显示了三个独立实验的典型FACS分析。
图3
图3
CXCR4在原代人和小鼠星状细胞中的表达随着培养诱导的激活而增加。（A） 取肝切除患者的正常肝组织，通过插管门脉血管用蛋白酶和胶原酶原位消化分离原代人HSC。通过密度离心分离星状细胞并将其镀在塑料上。相控显微镜描述了在培养过程中进行激活期间发生的表型变化。在激活的进行阶段（第3天、第21天和第3代），用PE结合的抗CXCR4抗体或同种对照物对HSC进行染色。来自三种独立分离物的代表性FACS分析显示，在培养诱导的活化过程中，细胞表面和总CXCR4表达增加。（B） CXCR4的细胞表面表达增加并逐渐激活以图形表示。（C） 作为概念验证，通过门静脉插管、原位消化和密度离心分离小鼠原代星状细胞。将收集的细胞（每次分离6只小鼠）贴在塑料上，并在培养第2天和第12天进行FACS。平均增加22%（n=3个独立隔离**P（P）<0.024）在进行性培养诱导激活期间，CXCR4受体表达。
图4
图4
LX-2和原代HSC分泌SDF-1α和外源性SDF-1α诱导剂量依赖性增加α-座椅模块组件。（A） SDF-1的酶联免疫吸附测定α在来自LX-2和第1代原代HSC的72小时条件培养基上进行的研究显示SDF-1的显著分泌α（2500–3000 pg/mL）。采用无血清培养基和PBS作为阴性对照。纯化重组人SDF-1α用于生成标准曲线。（B） 用增加浓度的SDF-1处理LX-2细胞α（100–750 ng/mL）和α-通过western blotting评估SMA和GAPDH作为负荷控制。（C） 在750 ng/mL时观察到最大诱导，并导致α-SMA蛋白表达通过密度测定归一化为GAPDH（n=3个独立实验**P（P）< 0.05). （D） 用对照shRNA（shControl）或CXCR4靶向shRNA（chCXCR4）转染LX-2细胞，并进行western blotting以确定敲除效率。转染72小时后发现CXCR4蛋白表达减少。（E） 转染72小时后，用SDF-1处理细胞α（500ng/mL），并对α-SMA，显示出50%的降低α-shCXCR4存在时SMA表达。
图5
图5
SDF-1型α通过ERK 1/2和PI3K-Akt途径诱导永生化人类星状细胞增殖。（A） LX-2细胞以每孔20000个细胞的密度进行电镀，缺血清48小时，并用增加浓度的SDF-1处理α（50、200和500 ng/mL）持续24至72小时，通过[三H] -胸腺嘧啶掺入。SDF-1的剂量依赖性效应α在所有时间点均观察到星状细胞增殖。（B） 用shControl或shCXCR4转染LX-2细胞，然后用SDF-1处理α（500 ng/mL）24至72小时，通过[三H] -胸腺嘧啶掺入。A 50%(**P（P）<0.007）和45%(*P（P）与shControl相比，shCXCR4在48和72小时时的增殖减少。（C） 确定SDF-1α激活ERK 1/2或PI3K-Akt通路，用对照（C）或SDF-1处理LX-2细胞α（S） 以500 ng/mL的剂量持续15、30和60分钟，并对磷酸化ERK 1/2、总ERK和α-微管蛋白作为负荷控制。（D） 用对照或SDF-1处理LX-2细胞α30、60和120分钟，对p-Akt、总Akt和β-肌动蛋白。在对SDF-1的反应中，发现磷酸化ERK1/2和p-Akt均增加α（E）用ERK抑制剂（UO126；10 nM）或PI3K抑制剂（LY294002；25）对细胞进行预处理μM） SDF-1前30分钟α治疗导致SDF-1显著下降α–诱导星状细胞增殖超过50%(***P（P）< 0.001). 所有数据均表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。在这两种抑制剂存在的情况下，发现了协同效应。
图6
图6
SDF-1型α在原发性人类HSC中诱导由ERK 1/2和PI3K-AKt途径介导的增殖反应。（A） 通道3初级HSC以2×10的密度进行电镀4，血清饥饿48小时，然后用SDF-1治疗α（500 ng/mL）持续24至72小时，并使用3H-胸腺嘧啶掺入法测量增殖反应。SDF-1型α在所有时间点诱导显著增殖反应**P（P）< 0.05, ***P（P）与对照组相比<0.005。（B） 通过蛋白质印迹分析证实了在原代人HSC中实现CXCR4敲除的能力。（C） 转染shControl或shCXCR4的原代HSC随后用SDF-1处理α24至72小时。SDF-1减少α24小时诱导增殖20%(*P（P）<0.01），48小时时为38%(**P（P）<0.005），72小时时为36%(**P（P）< 0.005). （D） ERK1/2（U0126；10 nM）和PI3K（LY294002；25μM） 导致SDF-1早日完全废除α–诱导增殖反应。所有数据均表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。
图7
图7
SDF-1型α主要通过PI3K-Akt途径促进I型胶原表达。用SDF-1处理（A，B）LX-2细胞α（500 ng/mL）持续2、6和12小时，提取RNA用于RT-PCR分析（A），提取蛋白质用于western blot分析（B），以检测I型胶原水平α1mRNA和I型胶原蛋白。（C） 用shControl和shCXCR4转染LX-2细胞，然后用SDF-1处理α12小时后，进行I型胶原的western blot分析。SDF-1显著减少α在shCXCR4处理的细胞中观察到–诱导的I型胶原表达。（D） 将LX-2细胞与ERK1/2抑制剂（UO126）或PI3K抑制剂（LY294002）预孵育30分钟，然后进行SDF-1α（500 ng/mL）持续6小时。这两种抑制剂均导致I型胶原蛋白表达在western blotting上降低，但在PI3K抑制剂存在时效果更为明显。显示了来自三个独立实验的代表性western印迹。
图8
图8
SDF-1型αCXCR7不介导对星状细胞增殖和I型胶原表达的影响。（A） FACS用于测定CXCR7的细胞表面表达（范围为21%-33%）。（B） 用非靶向shRNA（shControl）或CXCR7-靶向shRNA（shCXCR7）转染LX2细胞，对细胞裂解物进行的western blot分析显示CXCR7表达减少50%。（C，D）LX-2细胞缺乏血清，用shControl或shCXCR7转染72小时后用SDF-1处理α（500毫克/毫升）。通过胸苷掺入（C）评估增殖，通过western blot分析（D）评估I型胶原表达。SDF-1未减少αshCXCR7可诱导增殖或I型胶原表达。所有实验均一式三份。
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