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.2009年7月24日；284(30):20349-63.
doi:10.1074/jbc。M109.004580。 Epub 2009年5月8日。

斑马鱼细胞中一种新的线粒体鞘磷脂酶

武士雅布 1, Akio Shimuzu公司, 山下美治
附属公司

斑马鱼细胞中一种新的线粒体鞘磷脂酶

武士雅布等。 生物化学杂志. .

摘要

鞘磷脂是许多生物过程中的重要信号分子，但对其在线粒体中的生理作用知之甚少。我们重点研究了一种新型鞘磷脂酶（SMase）的生化特性及其在斑马鱼胚胎细胞线粒体神经酰胺生成中的作用。克隆的SMase cDNA编码545个氨基酸残基的多肽（推定分子量61300），包含线粒体定位信号（MLS）和预测的跨膜结构域。成熟内源酶的分子量预计为57000，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析表明，成熟酶的N-末端氨基酸残基为Ala-36。纯化的酶在pH 7.5的条件下，在10mm Mg（2+）存在下最佳水解[（14）C]鞘磷脂。在过度表达SMase cDNA的HEK293细胞中，该酶定位于线粒体部分，而缺乏MLS或MLS和跨膜结构域的突变蛋白则不存在于线粒体部分。内源性SMase蛋白与线粒体细胞染色标记共定位。通过蛋白酶保护试验，我们发现SMase分布在线粒体的膜间空间和/或内膜。此外，SMase在HEK293细胞中的过度表达诱导了线粒体部分神经酰胺的生成和鞘磷脂水解。反义硫代磷酸寡核苷酸诱导的敲除抑制了斑马鱼胚胎细胞线粒体部分的神经酰胺生成和鞘磷脂水解。这些观察结果表明，SMase催化鞘磷脂水解，并在鱼类细胞线粒体中生成神经酰胺。

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数字

图1。
图1。
斑马鱼线粒体SMase和中性SMase 2的氨基酸序列以及脊椎动物中性SMase之间的系统发育关系。 A类推导了斑马鱼线粒体SMase的氨基酸序列。氨基酸位置显示在正确的SMART计划确定的假定MLS为下划线的。经MALDI-TOF-MS测定，纯化成熟酶的N-末端氨基酸序列为装箱的SMART程序识别的假定跨膜结构域为双下划线.推定镁2+-图中显示了络合谷氨酰胺残基（Δ）、参与底物结合的天门冬氨酸残基（#）和催化碱组氨酸残基（*）。B类斑马鱼线粒体SMase、斑马鱼中性SMase 2、人类中性SMase1和小鼠中性SMase2的氨基酸序列比对。使用GenBank的FASTA搜索鉴定了具有显著氨基酸序列同源性的蛋白质TM（TM）数据库。利用斑马鱼线粒体SMase、斑马鱼中性SMase 2、人类中性SMase2和小鼠神经SMase 2中同源蛋白的推导氨基酸序列对中性SMases的序列进行比对。假定MLS为装箱的(我)。假定的跨膜结构域也是装箱的(二).C类，基于脊椎动物中性SMase氨基酸序列的系统发育树。使用ClustalX中的邻居连接方法进行系统发育分析。数字在内部分支上表示1000个复制的引导百分比。这个规模表示每个位点一个氨基酸替换的进化距离。分析中使用的氨基酸序列来自NCBI蛋白质数据库，其登录号如下：蜡样芽孢杆菌SMase（X12854）；人中性SMase 1和SMase 2（分别为NM_009213和AJ250460）；小鼠中性SMase 1和SMase 2（分别为NM_009213和AJ250461）；斑马鱼中性SMase 1和SMase 2（分别为AB196165和AB361067）；斑马鱼线粒体SMase（AB361066）。
图2。
图2。
斑马鱼胚胎细胞系线粒体SMase的纯化和表征。 A类纯化酶的PAGE。这个箭头表示57kDa蛋白质的分子量。样品还原后进行SDS-PAGE（10%凝胶）。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。B类中性SMase活性的pH依赖性。纯化酶的鞘磷脂水解活性在37°C下在不同pH值下测定30分钟，估计最佳pH值为7.5。通过添加最终浓度为100 m的以下缓冲液来调整pH值米：醋酸盐（pH 4和5）、管道（pH 6、6.5和7）和Tris（pH 7.5、8、8.5和9）。C类，镁的影响2+离子对中性鞘磷脂的水解活性。基础分析混合物含有100 m米三氯化氢（pH 7.5），5 m米氯化镁20.1%Triton®声波风廓线仪X-100和5米米DTT公司。镁的影响2+在10m的存在下测量离子对活性的影响米EDTA公司。D类，脂质对线粒体SMase活性的影响。纯化酶的鞘磷脂水解活性在标准条件下在[14C] 标准条件下的鞘磷脂和指示的磷脂（50或100μ米)。基础酶活性（对照）为45±3μmol/mg/h。
图3。
图3。
SMase的亚细胞定位和分布。 A类，ZE细胞的全裂解物(车道1)被分成线粒体部分(车道2)，细胞溶质部分(车道3)、和微粒体分数(车道4)通过超速离心。使用斑马鱼线粒体SMase、HSP60（线粒体标记物）、醛缩酶（细胞溶质标记物）和中性SMase 1和钙粘蛋白（细胞膜标记物）抗体，通过Western blotting分析这些组分。B类使用蔗糖梯度超速离心将线粒体级分分离为八个级分。使用斑马鱼线粒体SMase、HSP60和细胞色素抗体对每个组分中分离的蛋白质进行蛋白质印迹c（c）测定了每个组分中的线粒体标记、KDEL蛋白（内质网标记）、58-kDa蛋白（高尔基标记）、组织蛋白酶L（溶酶体标记）和过氧化氢酶（过氧化物酶体标志）以及中性SMase活性。溶酶体标记、内质网标记和高尔基体标记、线粒体标记或过氧化物酶体标记在分数1和2，分数4–6、和分数7和8分别是。C类ZE细胞亚细胞分离中标记酶的特异性活性。线粒体细胞色素SMase的C6-NBD-鞘磷脂水解活性c（c）氧化酶，内质网细胞色素c（c）通过亚细胞分馏测定每个组分中的还原酶和溶酶体酸性磷酸酶。值和酒吧表示三个独立实验的平均值±S.D。D类ZE细胞固定并用0.1%Triton X-100渗透。用100 n培养细胞米MitoTracker Red，然后用4%多聚甲醛固定在PBS中。细胞与抗斑马鱼SMase抗体和HSP60蛋白（线粒体标记物）或KDEL蛋白（内质网标记物）抗体共同染色，并用荧光二级抗体染色。SMase信号(绿色彩色图像）和亚细胞标记信号，如线粒体和内质网(红色彩色图像）。覆盖图像显示SMase，亚细胞标记按照“实验程序”中的描述在样本位置或相邻位置共存比例尺，10微米。E类SMase在线粒体中的分布。从斑马鱼胚胎细胞系中获得线粒体组分，并在0°C下培养30分钟(车道1)或存在(车道2–4)蛋白酶K，膨胀条件下（20 m米HEPES氢氧化钠（pH 7.4），10米米原钒酸钠，20 m米氟化钠，250米米蔗糖，2米米氯化钙2) (车道3和4)或在场时(车道4)Triton®声波风廓线仪X-100。样品用抗线粒体SMase、抗细胞色素进行Western印迹c（c）和抗HSP60抗体。
图4。
图4。
SMase变体的线粒体定位。 A类，SMase构造的示意图表示。B类，HEK293细胞仅用其构建物瞬时转染。车道1，控制；车道2，模拟；车道3，野生型；车道4，H529A突变体；车道5，MLS缺失突变体；车道6，TM缺失突变体；车道7，MLS-TM缺失突变体。转染后48小时，使用抗FLAG抗体或抗肌动蛋白通过Western blotting检测表达的蛋白质，如“实验程序”所述C类，表达所示结构的HEK293细胞被分为线粒体(1–7车道)和细胞溶质(车道8-14)使用FLAG、SMase、细胞色素抗体进行Western blotting分析c（c）和醛缩酶。车道1和8，控制；车道2和9，模拟；车道3和10，野生型；车道4和11，H529A突变体；车道5和12，MLS缺失突变体；车道6和13，TM缺失突变体；车道7和14，MLS-TM缺失突变体。D类野生型结构的线粒体定位。转染野生型SMase和MLS缺失突变体的HEK293细胞用25 n孵育米MitoTracker Red，用4%多聚甲醛固定在PBS中。细胞用抗FLAG抗体共同染色。带有FLAG标签的斑马鱼SMase信号(绿色彩色图像）和线粒体标记信号(红色彩色图像）和叠加图像（合并）按照“实验程序”进行观察
图5。
图5。
神经酰胺和鞘磷脂水平与SMase转染剂中中性SMase活性相关。在转染后的指定时间提取细胞脂质。神经酰胺的含量(A类)和鞘磷脂(C类)分别采用二酰甘油激酶法和TLC分离后的磷酸盐测定法进行定量。细胞被裂解，C6-NBD-鞘磷脂水解活性(B类)按照“实验程序”中的说明确定值和酒吧表示三个独立实验的平均值±S.D。
图6。
图6。
中性SMase活性增加，神经酰胺增加，SMase转染物线粒体部分的鞘磷脂水平降低。用野生型或H529A突变体构建物稳定转染HEK293细胞。按照“实验程序”所述建立了三个野生型和三个H529A突变株系(A类)使用“实验程序”中描述的抗FLAG抗体通过Western blotting检测B类通过TLC分离证明线粒体部分中中性SMase对C6-NBD-鞘磷脂的活性，并在254nm处通过紫外线照射进行可视化。C类，野生型细胞系中性SMase活性增加。裂解细胞，并按照“实验程序”中的描述测定C6 NBD鞘磷脂水解活性D类增加了三个野生型品系线粒体部分的神经酰胺含量。E类，降低从三个野生型品系分离的线粒体部分的鞘磷脂含量。提取线粒体部分中的细胞脂质，并分别使用二酰甘油激酶分析和磷酸盐测量来量化神经酰胺和鞘磷脂的水平。值和酒吧表示三个独立实验的平均值±S.D。不同的字母表示野生型和H529A突变细胞之间的统计差异(第页< 0.01).
图7。
图7。
抗线粒体SMase蛋白的反义寡核苷酸抑制神经酰胺生成。用0–20μ米反义或20μ米检测寡核苷酸对抗线粒体SMase 48小时。A类用抗线粒体SMase或抗肌动蛋白抗体通过Western blotting检测寡核苷酸处理细胞中的表达蛋白，如“实验程序”所述B类，C6-NBD-鞘磷脂水解活性；C类，神经酰胺含量；和D类线粒体组分中鞘磷脂含量。值和酒吧表示三个独立实验的平均值±S.D.。*，第页< 0.01与sense寡核苷酸处理的细胞。
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