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.2009年7月1日；107(4):759-68.
doi:10.1002/jcb.22174。

营养胁迫下脯氨酸氧化酶的调节与功能

聚熊猫 1, 史蒂文·唐纳德, 桑德拉·库珀, 詹姆斯·M·彭
附属公司

营养胁迫下脯氨酸氧化酶的调节与功能

聚熊猫等。 J细胞生物化学. .

摘要

在营养应激条件下，细胞会转换为生存模式，分解细胞和组织成分以获取能量。脯氨酸代谢在营养应激中尤其重要，因为脯氨酸很容易从细胞外基质（ECM）的分解中获得，脯氨酸氧化酶（POX）是一种线粒体内膜酶，通过脯氨酸循环降解脯氨酸可以生成ATP。这种降解途径产生谷氨酸和α-酮戊二酸，这些产物可以在TCA循环中发挥补体作用。此外，脯氨酸循环与戊糖磷酸途径处于代谢连锁状态，提供了另一种生物能量机制。在此，我们研究了脯氨酸代谢在RKO结直肠癌细胞系营养应激条件下的作用。通过葡萄糖戒断或雷帕霉素治疗诱导应激，刺激脯氨酸降解并增加POX催化活性。在这些情况下，POX至少部分负责维持ATP水平。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR）激活细胞能量传感器AMP-activated protein kinase（AMPK），也显著上调POX和增加POX-dependent ATP水平，进一步支持其在应激中的作用。葡萄糖剥夺增加了细胞内脯氨酸水平，POX的表达激活了戊糖磷酸途径。总之，这些结果表明，在营养应激条件下诱导脯氨酸循环可能是细胞转换到分解代谢模式以维持细胞能量水平的机制。

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数字

图1
图1。脯氨酸代谢示意图
脯氨酸（PRO）降解的第一步是通过脯氨酸氧化酶（POX）将其转化为吡咯烷-5-羧酸盐（P5C）。P5C可以通过P5C还原酶（P5CR）还原为脯氨酸，也可以通过吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CD）转化为谷氨酸并进入TCA循环，或者通过鸟氨酸氨基转移酶（OAT）转化为鸟氨酸并进入尿素循环。
图2
图2。雷帕霉素诱导的营养应激和葡萄糖戒断诱导POX
（A） （A）用雷帕霉素（10nmol/L）或二甲基亚砜（DMSO）处理RKO细胞不同时间段，并测量POX催化活性。葡萄糖浓度为5 mM。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。（b） RKO细胞暴露于含有不同浓度雷帕霉素的培养基中24小时；收集细胞裂解物，并测定POX催化活性。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E.。**，p<0.005是雷帕霉素处理细胞与未处理细胞的比较。（B） RKO细胞暴露于葡萄糖浓度从5mM（对照）降至0.01mM的培养基中24小时；（a） 免疫印迹法测定内源性POX蛋白水平；用密度计分析POX的谱带。（b） 测定POX催化活性，（c）用含有0.05 mM葡萄糖的培养基处理RKO细胞，并在不同时间点收集。收集细胞裂解物，并测定POX催化活性。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E.。**，葡萄糖剥夺细胞与对照细胞的比较p<0.005。
图2
图2。雷帕霉素诱导的营养应激和葡萄糖戒断诱导POX
（A） （A）用雷帕霉素（10nmol/L）或二甲基亚砜（DMSO）处理RKO细胞不同时间段，并测量POX催化活性。葡萄糖浓度为5 mM。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。（b） RKO细胞暴露于含有不同浓度雷帕霉素的培养基中24小时；收集细胞裂解物，并测定POX催化活性。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E.。**，p<0.005是雷帕霉素处理细胞与未处理细胞的比较。（B） RKO细胞暴露于葡萄糖浓度从5mM（对照）降至0.01mM的培养基中24小时；（a） 免疫印迹法测定内源性POX蛋白水平；用密度计分析POX的谱带。（b） 测定POX催化活性，（c）用含有0.05 mM葡萄糖的培养基处理RKO细胞，并在不同时间点收集。收获细胞裂解物，并测定POX的催化活性。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E.。**，葡萄糖剥夺细胞与对照细胞的比较p<0.005。
图3
图3。雷帕霉素和葡萄糖戒断对细胞内ATP水平的影响
RKO细胞暴露于A）葡萄糖浓度从5mM（对照）降至0.01mM的培养基中；B） 雷帕霉素（10nmol/L）或二甲基亚砜（DMSO）在不同时间段作为对照，C）雷帕霉素在存在和不存在10mM脯氨酸/脱氢脯氨酸（DHP）的情况下作为对照。对细胞进行裂解，并使用基于荧光素酶的分析测定细胞内ATP水平。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。统计比较如下：对于B，**，雷帕霉素治疗组与相应对照组相比，p<0.005；对于C，**，与不含雷帕霉素的对照组相比，经雷帕霉素处理的样品p<0.005；++，经脱氢脯氨酸（DHP）处理的样品与未经DHP处理的相应样品相比，p<0.005。
图3
图3。雷帕霉素和停糖对细胞内ATP水平的影响
RKO细胞暴露于A）葡萄糖浓度从5mM（对照）降至0.01mM的培养基中；B） 雷帕霉素（10nmol/L）或二甲基亚砜（DMSO）在不同时间段作为对照，C）雷帕霉素在存在和不存在10mM脯氨酸/脱氢脯氨酸（DHP）的情况下作为对照。对细胞进行裂解，并使用基于荧光素酶的分析测定细胞内ATP水平。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。统计比较如下：对于B，**，雷帕霉素治疗组与相应对照组相比，p<0.005；对于C，**，与不含雷帕霉素的对照组相比，经雷帕霉素处理的样品p<0.005；++，经脱氢脯氨酸（DHP）处理的样品与未经DHP处理的相应样品相比，p<0.005。
图4
图4。葡萄糖缺乏条件下POX的激活可能由AMPK介导
A） 将RKO细胞暴露于葡萄糖浓度从5mM（对照）降至0.01mM的培养基中，通过western blot分析监测Thr 172磷酸化对AMPK的激活。（B） 对照组用AICAR（0.5 mM）或DMSO处理RKO细胞，并在不同时间点收集；（a） western blot分析监测Thr 172磷酸化激活AMPK和内源性POX蛋白水平；用密度法分析磷酸化AMPK和POX的谱带。（b） 用AICAR（0.5 mM）处理不同时间的细胞，测定POX催化活性。（C） RKO细胞暴露于含有不同浓度AICAR的培养基中24小时；收集细胞裂解物，并测定POX催化活性。（D） 在有无葡萄糖的情况下，用AICAR（0.5 mM）处理RKO细胞，并测定POX催化活性。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E.。**，AICAR处理细胞与未处理细胞的比较p<0.005。
图4
图4。葡萄糖缺乏条件下POX的激活可能由AMPK介导
A） 将RKO细胞暴露于葡萄糖浓度从5mM（对照）降至0.01mM的培养基中，通过western blot分析监测Thr 172磷酸化对AMPK的激活。（B） 用对照中的AICAR（0.5mM）或DMSO处理RKO细胞，并在不同时间点收集；（a） western blot分析监测Thr 172磷酸化激活AMPK和内源性POX蛋白水平；磷酸化AMPK和POX的谱带通过密度计进行分析。（b） 用AICAR（0.5 mM）处理不同时间的细胞，测定POX催化活性。（C） RKO细胞暴露于含有不同浓度AICAR的培养基中24小时；收集细胞裂解物，并测定POX催化活性。（D） 在有无葡萄糖的情况下，用AICAR（0.5 mM）处理RKO细胞，并测定POX催化活性。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E.。**，AICAR处理细胞与未处理细胞的比较p<0.005。
图5
图5。停糖对MMP-2/-9活性和细胞内脯氨酸水平的影响
Aa）RKO细胞在无血清培养基中培养24小时，培养基中含有不同浓度的葡萄糖，浓度为5mM（对照）至0.01mM。处理后，浓缩培养基，并通过酶谱分析等量蛋白质对MMP-2和MMP-9的激活；（b） 该图显示了图5Aa中MMP-2和MMP-9条带的密度分析。细胞暴露于B）葡萄糖浓度降低的培养基中，如图所示；和C）0.01 mM葡萄糖，并在不同时间采集。治疗后，采集所有细胞，并按照“材料和方法”**中的描述测量细胞内脯氨酸水平，与葡萄糖缺乏细胞相比，p<0.005。
图6
图6。POX诱导对戊糖磷酸途径的影响
A） RKO细胞暴露于含有和不含雷帕霉素10 nmol/L和14一氧化碳2按照“材料和方法”中的描述收集。B） 不使用强力霉素培养DLD-POX细胞以诱导POX。对照细胞在强力霉素（20 ng/ml）存在下培养。在两种条件下培养的细胞与葡萄糖-1孵育-14C，葡萄糖浓度如图所示，以及14一氧化碳2如上所述收集。活性显示为每毫克细胞蛋白每小时利用的葡萄糖。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。C） DLD-POX细胞在含有0.05 mM葡萄糖的培养基中培养；添加或不添加强力霉素诱导POX。裂解细胞，并使用基于荧光素酶的测定法测量细胞内ATP水平。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。A:**的统计比较，与对照组相比p<0.005；对于B&C，**，与POX诱导（tet-）细胞和未诱导（tet+）细胞相比，p<0.005。
图6
图6。POX诱导对戊糖磷酸途径的影响
A） RKO细胞暴露于含有和不含雷帕霉素10 nmol/L和14一氧化碳2按照“材料和方法”中的描述收集。B） 不使用强力霉素培养DLD-POX细胞以诱导POX。对照细胞在强力霉素（20 ng/ml）存在下培养。在两种条件下培养的细胞与葡萄糖-1孵育-14C，葡萄糖浓度如图所示，以及14一氧化碳2如上所述收集。活性显示为每毫克细胞蛋白每小时利用的葡萄糖。对于三个单独的实验，结果表示为平均值±S.E。C） DLD-POX细胞在含有0.05 mM葡萄糖的培养基中培养；添加或不添加强力霉素诱导POX。对细胞进行裂解，并使用基于荧光素酶的分析测定细胞内ATP水平。三个单独实验的结果表示为平均值±S.E。A:**的统计比较，与对照组相比p<0.005；对于B&C，**，与POX诱导（tet-）细胞和未诱导（tet+）细胞相比，p<0.005。
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