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.2009年7月2日；114（1）:165-73。
doi:10.1182/bloud-2008-10-180489。 Epub 2009年5月1日。

GATA-1与p53相关并抑制p53

Cecelia D Trainor公司 1, 卡罗琳·马斯, 帕特里克·阿尔坎鲍尔, 保拉·迪莱洛, 詹姆斯·奥米钦斯基
附属公司

GATA-1与p53结合并抑制p53

Cecelia D Trainor公司等。 血液. .

摘要

除了协调所有红细胞特异性基因的表达外，GATA-1还通过调控调控细胞周期和凋亡的基因来控制红细胞系的生长、分化和存活。哺乳动物红细胞生成的阶段包括全基因失活、核浓缩和去核以产生循环红细胞，在此过程中GATA-1改变表达的一些基因是p53通路的成员。在本研究中，我们证明了p53反式激活结构域（p53TAD）与GATA-1 DNA结合结构域（包括羧基末端锌指结构域）的一段片段之间的特定体外相互作用。我们还通过免疫沉淀法表明，天然GATA-1和p53在红细胞中相互作用，红细胞系中p53应答启动子的激活可被GATA-1的过度表达所抑制。突变分析显示，GATA-1对p53的抑制最低限度地需要与p53TAD相互作用的GATA-1 DNA结合结构域的片段。这种抑制是相互的，因为GATA-1反应启动子的激活可以被p53抑制。基于这些发现，我们得出结论，GATA-1对p53通路的抑制可能对红细胞的发育和存活至关重要。

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图1
图1
在体外下拉试验中，全长p53TAD与GATA-1的锌指结构域结合（A）p53的TAD示意图，显示全长p53TAD的位置和两个独立的亚域p53TAD1和p53TAD2的位置。（B） p53TAD和p53TAD1与GST-GATA-1 ZFD（GATA-1）的结合199-317). 用1μM GST-GATA-1 ZFD培养不同浓度（1.0、0.1和0.01μM）的p53TAD（5-7道）和p53TAD1（8-10道）。在GST通道中，用1μM GST培养1μM纯化的p53TAD（通道3）和p53TAD1（通道4）作为对照。输入车道为p53TAD（车道1）和p53TAD1（车道2），为0.5%。用抗p53抗体DO-1检测结合蛋白。（C） p53TAD和p53TAD2与GATA-1 ZFD的结合。用1μM GST-GATA-1 ZFD培养不同浓度（1.0、0.1和0.01μM）的p53TAD（5-7道）和p53TAD2（8-10道）。在GST通道中，用1μM GST培养1μM纯化的p53TAD（通道3）和p53TAD2（通道4）作为对照。输入通道是0.5%的p53TAD（通道1）和p53TAD2（通道2）。用抗p53抗体Pab 1801检测结合蛋白。
图2
图2
在体外下拉试验中，连接区、羧基末端锌指和GATA-1的基本臂足以结合p53TAD（A）GATA-1的示意图，突出锌指结构域（GATA-1 ZFD）和用作GST融合蛋白的GATA-1 ZFD的各种缺失突变体。（B） GST-GATA-1 ZFD和GST-GAGA-1 NF+L（GST-GATA-1）的比较结合200-251)至p53TAD。将不同浓度（1.0、0.1和0.01μM）的p53TAD与1μM GST-GATA-1 ZFD（3-5道）或GST-GACA-1 NF+L（6-8道）孵育。在GST通道中，1μM纯化p53TAD与1μM GST孵育作为对照（通道2）。输入车道为0.5%p53TAD（车道1）。（C） GST-GATA-1 ZFD和GST-GACA-1 L加CF的比较结合228-317)至p53TAD。不同浓度（1.0、0.1和0.01μM）的p53TAD与1μM GST-GATA-1 ZFD（3-5道）或GATA-1 L加CF（6-8道）孵育。在GST通道中，1μM纯化p53TAD与1μM GST孵育作为对照（通道2）。输入车道为0.5%p53TAD（车道1）。（D） GST-GATA-1 ZFD和GST-GACA-1 CF的比较结合252-317)至p53TAD。不同浓度（1.0、0.1和0.01μM）的p53TAD与1μM GST-GATA-1 ZFD（3-5道）或GATA-1 CF+BA（6-8道）孵育。在GST泳道中，将1μM纯化的p53TAD与1μM GST一起孵育作为对照（泳道2）。输入车道为0.5%p53TAD（车道1）。在所有实验中，用抗p53抗体DO-1检测结合蛋白。
图3
图3
GATA-1和p53在MEL细胞提取物中的体外相互作用（A）共320μg MEL核提取物与以下物质孵育：通道1、4μL抗GATA-1 N6和1μL抗鼠IgG2a；通道2，4μL抗p53（PAB240）和1μL抗鼠IgG；通道3，5μL抗鼠IgG2在4℃下旋转1.5小时，添加40μL蛋白G和琼脂糖，在4℃再旋转4小时；4号通道，MEL核提取物。使用GATA-1 N6抗体显示了蛋白质印迹。（B） 通道1、8μL抗GATA-1 N6和1μL抗鼠IgG2a；通道2，8μL抗p53（PAB 246）和1μL抗鼠IgG；通道3、8μL抗细胞周期素B1（GNS1）和1μL抗鼠IgG在4°C下旋转1.5小时，并在4°C下再旋转4小时，添加40μL蛋白G和琼脂糖；泳道4，MEL核提取物。显示了HRP结合抗p53蛋白的Western blot。
图4
图4
GATA-1、p53TAD和GATA-1 DNA结合位点不形成三元络合物.（A）2D的叠加1H（H）-150.5 mM样品的N HSQC光谱15N标记的GATA-1 L加CF/DNA复合物（黑色），存在0.5 mM未标记的p53TAD（红色）。（B） 2D的叠加1H（H）-150.5 mM样品的N HSQC光谱15自由形式（黑色）的N标记p53TAD，存在0.5 mM未标记GATA-1 L加CF/DNA复合物（红色）。
图5
图5
GATA-1可通过p53抑制6C2细胞的反式激活（A）所有样本均转染150 ng CMV雷尼利亚荧光素酶和0.5μg p53 Luc报告质粒；将0.25μg CMV p53添加到除第一个样本外的所有样本中。添加越来越多的RSV-Cat、空RSV表达载体或RSV hGATA-1（1、2和3μg DNA）。在样本的等分样品上进行双荧光素酶报告分析，萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚绘制荧光素酶。误差条表示标准偏差，n=3。由Student将RSV Cat和空载体的2个最高DNA浓度的平均值与hGATA-1等重量的平均值进行比较t吨测试*P（P）<0.05和**P（P）< .005. （B） 在6次转染中比较RSV-Cat和hGATA-1。结果标准化为雷尼利亚荧光素酶活性。然后将1μg RSV-Cat的萤火虫荧光素酶值设置为100%，所有其他值均归一化为该值。误差条表示标准偏差，n=6。我们比较了RSV-Cat和hGATA-1质粒的两个最高DNA浓度的等重平均值，以测试学生的统计显著性t吨测试**P（P）< .005. （C） 添加CMV进行类似转染雷尼利亚荧光素酶、p53 Luc报告质粒和CMV p53转染所有样本，并共同转染越来越多的RSV-Cat或RSV hGATA-1。细胞在收获时分裂，一半用于双荧光素酶报告分析，另一半用于HRP-结合抗p53抗体（顶部）和抗GAPDH抗体（底部）的Western印迹。
图6
图6
锌指和GATA-1的CF之间的连接物是抑制p53所必需的（A）小鼠GATA-1的缺失突变体的示意图。（B） 如图5图例所示，对6C2细胞进行转染。总计150 ng CMV雷尼利亚所有样本中均存在荧光素酶、0.5μg p53 Luc报告质粒和0.25μg CMV p53，而按指示添加了不同数量的小鼠野生型GATA-1表达载体或突变体（1、2或3μg）。归一化后雷尼利亚荧光素酶活性，将1μgΔCF的萤火虫荧光素酶值设置为100%，并相应调整所有其他样品的值。误差条表示标准偏差，实验进行了4到7次。我们比较了Student的两种最高DNA浓度ΔNFL、ΔNF和ΔCF与野生型的等重平均值t吨测试，以及*P（P）< .05. （C） CMV公司雷尼利亚荧光素酶和1μg的FR7Luc（GATA-1反应性报告质粒）被转染到QT6纤维母细胞中，小鼠GATA-1表达质粒的数量增加，如图所示（0.5、1或2μg）。归一化和误差条如（B）所示，2μg野生型GATA-1的值设置为100%。Student将两种最低浓度野生型的等重平均值与所有其他结构的等重均数进行了比较t吨测试**P（P）<.005和***P（P）< .0005.
图7
图7
第53页1-65可以与野生型p53竞争与GATA-1的结合，并减少p53的抑制作用（A）显示了通过在CMV p53表达载体中插入翻译终止信号来生成肽1-65和1-40的构造示意图。（B） CMV转染试验雷尼利亚所有样本中均存在荧光素酶、p53 Luc报告质粒和CMV p53，mGATA-1的表达质粒与6μg空载体（bar 2）、5或6μg CMV p531-65（bar 3和4）或CMVp531-40（bar 5和6）一起添加到样本2-6中，如图所示。对于最后2个样本，使用不干扰p53反式激活的突变体GATA-CM代替野生型GATA-1，并添加6μg CMV 1-65（bar 7）或6μg CMCV 1-40（bar 8）。归一化如图6图例所示，GATA-1 CM 65的平均值为5μg，40个样品设置为100%。结果是三次实验的平均值，误差条表示标准偏差。学生比较了DNA的等重平均值t吨试验，如图所示*P（P）<0.05和**P（P）< .005.
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