Rho kinase-1 mediates cardiac fibrosis by regulating fibroblast precursor cell differentiation

doi:10.1093/cvr/cvp135

.2009年8月1日；83(3):511-8.

doi:10.1093/cvr/cvp135。 Epub 2009年4月30日。

Rho激酶-1通过调节成纤维细胞前体细胞分化介导心肌纤维化

桑德拉·B·豪德克¹, 达蒙·古普塔, 奥利弗·德瓦尔德, 罗伯特·施瓦茨, 雷伟, JoAnn审判, 马克·伦特曼

附属公司

PMID： 19406912
预防性维修识别码： PMC2709463型
内政部： 10.1093/cvr/cvp135

Rho激酶-1通过调节成纤维细胞前体细胞分化介导心肌纤维化

桑德拉·B·豪德克等。心血管研究. 2009.

.2009年8月1日；83(3):511-8.

doi:10.1093/cvr/cvp135。 Epub 2009年4月30日。

作者

桑德拉·B·豪德克¹, 达蒙·古普塔, 奥利弗·德瓦尔德, 罗伯特·施瓦茨, 雷伟, JoAnn审判, 马克·伦特曼

附属

¹美国德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院和卫理公会医院德巴基心脏中心，贝勒广场一楼620层，邮编77030。shaudek@bcm.tmc.edu

PMID： 19406912
预防性维修识别码： PMC2709463型
内政部： 10.1093/cvr/cvp135

摘要

目的：在小鼠缺血/再灌注心肌病（I/RC）模型中，来源于单核细胞血载前体细胞的高度增殖的CD34+/CD45+成纤维细胞在纤维化的发展中起着关键作用。单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）诱导人单核细胞经内皮细胞迁移（TEM）后，体外分化为成纤维细胞。由于Rho相关激酶-1（ROCK-1）与纤维化和白细胞透射电镜有关，我们研究了它与I/RC的关系。

方法和结果：我们对ROCK-1基因缺失的小鼠进行I/RC。我们发现，ROCK-1（-/-）小鼠没有出现I/RC的纤维化和心脏功能障碍特征：与野生型相比，ROCK-1[-/-]小鼠心脏显示出I/RC诱导的α-平滑肌肌动蛋白+成纤维细胞和CD34+/CD45+成纤维前体细胞数量显著减少。从接受I/RC的ROCK-1（-/-）小鼠中分离出的心脏成纤维细胞体积大，增殖缓慢，与从未经处理的心脏中分离的成纤维细胞相似。我们还进行了体外实验，其中人类外周血单个核细胞（PBMC）通过内皮细胞迁移以响应MCP-1。在迁移之前，PBMC与ROCK-1靶向小干扰RNA孵育以沉默ROCK-1表达。我们发现，ROCK-1蛋白减少80%并不会抑制TEM，但显著减少了分化为成纤维细胞的单核细胞数量20倍以上。

结论：我们的数据表明，ROCK-1在分化中起着重要作用，但在成熟为心脏成纤维细胞的单核细胞的TEM中不起作用。这些细胞介导非适应性纤维化。

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数字

图1
岩石-1^−/−小鼠受到缺血/再灌注心肌病（I/RC）诱导的心脏功能障碍的保护。野生型（WT）和ROCK-1^−/−小鼠接受为期7天的I/RC。与WT小鼠相比，保留了ROCK-1的缺失(A类)分数缩短和(B类)前壁增厚(n个=每组5/8；^#*P（P）*假手术组和WT组之间<0.01；NS=不显著）。

图2
岩石-1^−/−小鼠受到缺血/再灌注心肌病（I/RC）诱导的心肌纤维化的保护。野生型（WT）和ROCK-1^−/−小鼠接受为期7天的I/RC。组织切片染色(A类)胶原蛋白（图像放大倍数：×100）(B类)α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），以及(C类)巨噬细胞。分析缺血和非缺血（后隔）区域；后者起到了内部控制的作用，因为该区域不应受到I/RC的影响。与野生型小鼠相比，ROCK-1^−/−小鼠受到保护：I/RC后，胶原间质沉积和α-SMA数量⁺细胞数低于WT小鼠。ROCK-1的缺失并没有减少巨噬细胞的数量。在劣质处理的WT和ROCK-1中^−/−小鼠缺血区和非缺血区胶原、α-SMA无差异⁺细胞和巨噬细胞（数据未显示）(n个=每组5/7；^#*P（P）*同一组内缺血性和非缺血性区域之间的差异<0.01**P（P）*缺血ROCK-1之间<0.01^−/−和WT组；NS=不显著）。(D类)3天I/RC后，ROCK-1中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）mRNA的表达没有降低^−/−小鼠与WT小鼠的比较(n个=每组4/4；NS=不显著）；[巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1β，-1α，-2；干扰素-γ诱导蛋白（IP）-10；数据归一化为核糖体看家基因L32]。(E类)典型的western blot显示5天I/RC后的心肌ROCK-1和ROCK-2水平。GAPDH用作加载规范化。

图3
ROCK-1缺乏缺血/再灌注心肌病（I/RC）特征性成纤维细胞群^−/−老鼠。野生型（WT）和ROCK-1^−/−小鼠接受为期5天的I/RC。移除心脏并分离心脏成纤维细胞。(A类)分析分散细胞在活细胞（钙黄绿素）上的CD34和CD45表达⁺)流式细胞术检测细胞。删除ROCK-1减少了CD34的数量⁺，第45页⁺和CD34⁺/CD45型⁺与WT比较的单元格(n个=每组4人）。(B类)培养相同的细胞悬浮液*在体外*用相差显微镜（放大倍率：×200）观察形态。来自ROCK-1的细胞培养^−/−接受I/RC的小鼠表现出与假处理心脏培养物相似的形态学特征（大而平）。如前所述，WT心脏的培养物较小且呈纺锤形。(C类)ROCK-1的细胞隔离^−/−I/RC后的小鼠增殖（BrdU掺入）速度与sham处理小鼠的分离物增殖速度相似，而WT小鼠的分离体增殖速度是之前描述的两倍(n个=每组3/5；^#*P（P）*假手术组和I/RC组之间<0.05**P（P）*岩石-1之间<0.05^−/−和WT组）。对于所描述的参数，假WT和假ROCK-1之间没有差异^−/−老鼠；因此，两组动物被合并。

图4
ROCK-1靶向siRNA降低了人PBMC中ROCK-1蛋白的表达。用ROCK-1靶标siRNA 680、ROCK-1目标siRNA 846、非靶向siRNA（NT）或未经治疗（无T）对人PBMC进行治疗。(A类)显示ROCK-1和ROCK-2蛋白水平的典型蛋白质印迹和相应组数据。与无处理水平相比，siRNA 680和846均在不影响ROCK-2蛋白表达的情况下废除了ROCK-1(n个=每组6人；^#*P（P）*siRNA 680和846治疗组之间<0.05**P（P）*ROCK-1靶向siRNA治疗组和未治疗组之间的差异<0.001）。(B类)典型的细胞图显示，总细胞中90%以上的细胞钙黄绿素阳性，因此是活的，20%以上的活细胞是CD14⁺在ROCK-1靶向siRNA 680处理后，与未处理细胞无差异（数据未显示）。

图5
TEM不需要表达ROCK-1。用ROCK-1靶向siRNA 680、ROCK-1靶向siRNA 846、非靶向siRNA（NT）或未经处理（无T）预处理的人类外周血单个核细胞，允许其迁移通过人类心脏微血管内皮细胞（HCMEC）以响应MCP-1，但收集在内皮细胞层和过滤器之间的胶原垫中（孔径：0.4µm）。胶原蛋白垫被消化，CD45的总数⁺/CD14号机组⁺单核细胞计数采用流式细胞术。(A类)典型的细胞图显示CD14的数量⁺通过HCMEC迁移的单核细胞（PE标记）占所有CD45的约7%⁺细胞（FITC-标记）。(B类)当实验数据表示为“未治疗”数据的百分比时，相应的组数据显示组之间没有差异(n个=每组3人）。(C类)在没有内皮细胞的情况下，允许相同的组在琼脂糖垫中向MCP-1迁移。测定了MCP-1的净迁移量，并计算了迁移指数。各组间的趋化行为无差异(n个=每组3人）。

图6
成纤维细胞的形成需要ROCK-1的表达。用ROCK-1靶向siRNA 680、ROCK-1靶向siRNA 846、非靶向siRNA（NT）或未经处理（无T）预处理的人外周血单核细胞（PBMC）被允许通过人心脏微血管内皮细胞迁移以响应MCP-1。(A类)培养4天和11天后底部贴壁细胞的典型图像。成纤维细胞呈纺锤形且细长（左下角图像中插入相位对比剂，放大倍率：×200），I型胶原阳性（绿色；蓝色表示DAPI染色用于细胞核鉴定；放大倍率为×200）。巨噬细胞呈圆形，缺乏I型胶原表达。(B类)当实验数据表示为“未治疗”数据的百分比时，比较整个底部微孔中成纤维细胞总数的相应组数据（编号T:269±42；NT:264±40；siRNA 846:66±39，siRNA 680:11±2）。与未经处理的PBMC组相比，ROCK-1靶向siRNA处理的PBMCs组成纤维细胞形成显著减少，其中siRNA 680比siRNA 846更有效(n个=每组3人**P（P）*siRNA治疗组和未治疗组之间<0.001，^#*P（P）*在siRNA 680和siRNA 846之间<0.05）。

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