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.2009年4月15日；328(2):315-27.
doi:10.1016/j.ydbio.2009.01.031。 Epub 2009年2月3日。

维甲酸受体是出生后小鼠骨骼生长、基质内稳态和生长板功能所必需的

朱莉·威廉姆斯 1, 近藤直树, 冈部高弘, 竹下信夫, 黛安·米·皮尔查克, 小山英树, Takanaga Ochiai公司, 黛博拉·詹森, 蒙丽珠, 莫林·A·凯恩, 约瑟夫·L·那不勒斯, Motomi Enomoto岩本, 诺伯特·盖斯林克, 皮埃尔·查姆本, 毛里齐奥·帕西菲西, 岩本正弘
附属公司

维甲酸受体是出生后小鼠骨骼生长、基质内稳态和生长板功能所必需的

朱莉·威廉姆斯等。 求文献一篇. .

摘要

维甲酸受体α、β和γ（RARalpha、RARbeta和RARGama）是核激素受体，在胚胎发生过程中调节基本过程，但其在骨骼发育和生长中的作用尚不清楚。为了研究骨骼特异性RAR功能，我们创建了软骨中RAR表达缺陷的条件小鼠突变体。我们发现，出生后3周左右，缺乏RARα和RARγ（或RARβ和RAR伽玛）的小鼠表现出明显的严重生长迟缓。它们的生长板有缺陷，重要的是，聚集蛋白的表达和含量大幅下降。然而，缺乏RARα和RARβ的小鼠实际上是正常的，这表明RARγ是必需的。在良好的相关性中，我们发现RARgamma是小鼠生长板中表达最强烈的RAR，其表达特征是聚集蛋白也强烈表达的增殖区和前肥厚区。由于无血管，这些区域缺乏先前的RARE报告小鼠和我们的直接生化测量显示的内源性维甲酸，因此，RARgamma可能发挥无配体阻遏作用。事实上，我们的数据表明：在无维甲酸的培养条件下，软骨细胞中RARgamma的过度表达促进了聚集蛋白聚糖的生成；联合阻遏物Zac1或增强RAR阻遏剂功能的药物可进一步促进生成；RAR/Zac1对聚集蛋白表达的作用可能涉及Sox蛋白。总之，我们的数据表明，RARs，尤其是RARgamma，在生长板功能和骨骼生长中发挥着以前未被认可的作用，并调节聚集蛋白的表达和含量。由于聚集蛋白聚糖对生长板功能至关重要，因此RAR-突变小鼠缺乏聚集蛋白聚糖可能直接导致其生长迟缓。

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数字

图1
图1
风险调整比率长骨生长板的表达模式。(A-L公司)原位杂交分析风险调整比率α,风险调整比率β或风险调整比率使用野生型E15.5片段的γ表达(A-D公司)、1周龄（E-H）和3周龄(I-L公司)胫骨近端生长板和3周龄风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷胫骨生长板(M-P公司). 在(D类)，箭头指向上部生长板区，而箭头指向肥厚区。在(五十、 P（P）)，双箭头指向初级海绵。OC，次级骨化中心。尺寸棒：A-D，200μm；E-H，300μm；和I-P，75μm。
图2
图2
对照组和风险调整比率-缺陷小鼠。(A类)这两个风险调整比率β/风险调整比率右侧的5周龄γ缺乏小鼠（表示为βγ缺乏）明显小于左侧的对照鼠。(B类)5周龄对照组与对照组相比，体重无明显差异风险调整比率α/风险调整比率β缺乏的室友。(首席财务官)男性、女性对照组和双胎组的平均身体和股骨长度风险调整比率-8周龄缺陷小鼠。测量从鼻尖到骶骨区域的身体长度。本实验中分析的突变小鼠数量为：风险调整比率α/风险调整比率β-缺乏（αβ-def，n=13）和对照（αβ-cont，n=19），风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷（βγ-def，n=24）及其控制（βγ-cont，n=32），以及风险调整比率α/风险调整比率γ-缺乏（αγ-def，n=13）及其控制的同卵（n=14）。E和F中的对照是所有三个同窝对照的总和（n=65）。获得的数据经过Mann-Whitney检验。*与βγ-def相比p<0.05；#与αγ-def相比p<0.05
图3
图3
生长板组织、软骨细胞增殖和聚集蛋白聚糖表达分析。(A-L公司)3周龄儿童胫骨近端生长板连续切片(A-B、E-F和I-J)或5周龄(C-D、G-H和K-L)控制和风险调整比率β/随机存取存储器对γ缺乏的同窝鼠进行组织学分析(A-D公司)增殖标记物的原位杂交H4C型(E-H公司)或aggrecan（Agg）(I-L公司). 注意，突变生长板高度的降低（垂直绿线）主要影响上部区域（红线），在5周龄小鼠中更为明显。尺寸棒，75μm。
图4
图4
长骨的组织化学和μCT分析。(A-D公司)3周龄和5周龄对照组胫骨近端长骨生长板的纵切面风险调整比率β/风险调整比率用藏红O或阿尔西安蓝对γ-缺乏的窝友进行组织化学蛋白多糖染色。注意突变生长板中的染色显著减少。(E-H公司)5周龄对照组和风险调整比率β/风险调整比率用μCT扫描γ缺乏的室友，并将其视为2D图片(E-F公司)或3D剪贴画(G-H公司). 注意突变样本中的小梁骨显著减少。
图5
图5
蛋白质聚糖的合成和含量风险调整比率γ过表达和反向激动剂治疗。(A-B公司)蛋白质聚糖的合成风险调整比率β/风险调整比率γ-缺乏软骨细胞培养物过度表达风险调整比率γ (pCMV-HA-RAR病毒γ） 或使用反向激动剂治疗后。(C-H型)对照和风险调整比率β/风险调整比率未经处理的对照培养物（无）和用300 nM维甲酸（RA）或100 nM反向激动剂（INV）处理的伴随培养物中的γ-缺陷软骨细胞。(I-L公司)对照组和对照组阿尔西安蓝染色风险调整比率β/风险调整比率γ缺陷培养物用反向激动剂、RA或RARγ选择性激动剂治疗6天。在三个独立的实验中建立了结果的一致性。
图6
图6
分析Zac1号机组表达模式、相互作用和功能。(A类)：新生儿胫骨和股骨骺软骨转录共因子的实时PCR分析。表达水平是相对于GAPDH显示的。(B类)：的表达式模式Zac1号机组，聚合聚糖（Agc），风险调整比率γ和Sox9指数在高放大率（上图）和低放大率（下图）下观察的E15.5小鼠胚胎胫骨的纵向切片中。(C类)：在原代软骨细胞培养物中过度表达Zac1号机组和/或风险调整比率γ. 转染后24至36小时，在无维甲酸培养基中保存的培养物用35-硫酸盐脉冲标记。图中显示了三份培养基中的平均掺入+/-SD。*学生的p<0.05t检验对照空载体转染培养物的比较与Zac1和风险调整比率γ转染培养物。(D类)：RARγ和Zac1之间物理相互作用的免疫沉淀和免疫印迹分析（左面板）。与免疫前兔IgG相比，通过全细胞裂解物的免疫沉淀证实Zac1抗体的特异性（右图）。(E类)：原代培养软骨细胞中罕见的报告活性扎克1使用或不使用反向激动剂AGN处理的过度表达（左图）。使用或不使用维甲酸（RA）治疗的类似分析（右图）。(F类)：哺乳动物双杂交分析表明，RARγ和Zac1相互作用可引发非常强的报告活性（实心黑色柱）。pACT-MyoD和pBIND-Id作为阳性对照，无插入pACT和pBIND作为阴性对照。(克)智能池siRNA特异性混合物转染后原代培养软骨细胞中罕见的报告活性Zac1、RARα或风险调整比率γ无（-）或（+）与100nM反向激动剂联合治疗；对照组使用非特异性（NS）。(H-I公司)转染siRNAs后指示基因内源性RNA水平的RT-PCR分析Zac1号机组(H（H）)或风险调整比率γ (我)；注意，在每种情况下，只有靶RNA减少。所有报告检测的转染效率均通过联合转染的phRG-SV40载体产生的Renilla荧光素酶活性进行标准化。进行了两个独立的siRNA转染实验和三个独立的其他转染实验，并产生了类似的结果。
图7
图7
aggrecan和Sox9指数表达水平和模式。(A-C公司)阿格雷坎和Sox9指数表达水平（A-B）和4x48bp索克斯与未经处理的培养物相比，用100 nM反向激动剂（INV）或1μM RA处理的原代软骨细胞培养物中的报告活性（C）（无）。(D-K公司)很少有记者活动受到控制，风险调整比率α/风险调整比率β-,风险调整比率β/风险调整比率γ-和风险调整比率α/风险调整比率用反向激动剂、RA或RARγ选择性激动剂治疗前（无）或治疗后的γ缺陷软骨细胞培养物。所有报告基因测定重复3-5次，我们获得了可重复的结果。(L-O型)原位杂交分析Sox9指数3周龄（L-M）和5周龄（N-O）对照组（L和N）胫骨近端生长板中的表达风险调整比率β/风险调整比率γ-缺乏（M和O）的同窝伴侣。
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