Oxidative stress renders retinal pigment epithelial cells susceptible to complement-mediated injury

doi:10.1074/jbc.M808166200

.2009年6月19日；284(25):16939-16947.

doi:10.1074/jbc。M808166200。 Epub 2009年4月21日。

氧化应激使视网膜色素上皮细胞易受补体介导损伤

约书亚·M·瑟曼¹, 布兰登·雷纳¹, 坎南·昆奇塔帕萨姆², 维维亚娜·费雷拉^三, 迈克尔·K·彭伯恩^三, Zsolt Ablonczy公司², 史蒂芬·汤姆林森⁴, V迈克尔·霍尔斯¹, 巴贝尔·罗勒⁵

附属公司

¹来自科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学丹佛医学院医学系，邮编80045。
²南卡罗来纳州查尔斯顿市研究部眼科和神经科学系，邮编：29425。
^三德克萨斯州泰勒市德克萨斯大学健康科学中心生物化学系，邮编：75708。
⁴南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学微生物与免疫学系，29425。
⁵南卡罗来纳州查尔斯顿市研究部眼科和神经科学系，邮编：29425。电子地址：rohrer@musc.edu。

PMID： 19386604
预防性维修识别码：项目经理2719331
内政部： 10.1074/jbc。M808166200

氧化应激使视网膜色素上皮细胞易受补体介导损伤

约书亚·M·瑟曼等。生物化学杂志. 2009.

.2009年6月19日；284(25):16939-16947.

doi:10.1074/jbc。M808166200。 Epub 2009年4月21日。

作者

附属公司

¹来自科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学丹佛医学院医学系，邮编80045。
²南卡罗来纳州查尔斯顿市研究部眼科和神经科学系，邮编：29425。
^三德克萨斯州泰勒市德克萨斯大学健康科学中心生物化学系，邮编：75708。
⁴南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学微生物与免疫学系，29425。
⁵南卡罗来纳州查尔斯顿市研究部眼科和神经科学系，邮编：29425。电子地址：rohrer@musc.edu。

PMID： 19386604
预防性维修识别码：项目经理2719331
内政部： 10.1074/jbc。M808166200

摘要

补体替代途径的非受控激活被认为与年龄相关性黄斑变性（AMD）有关。替代途径在液相持续激活，组织表面需要持续的补体抑制，以防止自发的自体组织损伤。在这里，我们研究了氧化应激对永生化人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）调节细胞表面补体激活能力的影响。经皮电阻（TER）测定发现，用H（2）O（2）（诱导氧化应激）和补体充足的血清联合治疗可破坏稳定ARPE-19单层的屏障功能。这两种治疗都没有任何效果。TER降低与C3的细胞表面沉积增加相关，可通过使用C7-缺失血清（末端补体途径的重要组成部分）来预防。H（2）O（2）治疗降低了补体抑制剂DAF、CD55和CD59的表面表达，并通过血清中的因子H削弱了细胞表面的调节。用H（2）O（2）和血清联合处理单层细胞可诱导血管表皮生长因子（VEGF）的极化分泌。两者都可以通过使用替代途径抑制剂或阻断VEGF受体1/2信号来减弱VEGF的分泌和TER的减少。综上所述，这些研究表明，氧化应激降低了ARPE-19细胞表面补体的调节，增加了补体的激活。这种亚细胞激活导致VEGF释放，从而介导细胞单层的破坏。这些发现将氧化应激、补体激活和顶端VEGF释放联系起来，这些都与AMD的发病机制有关。

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数字

**图1。**
**氧化应激与正常人血清结合，由于补体激活而破坏ARPE-19单层。**生长ARPE-19细胞，直到获得稳定的TER。A类，用H处理细胞₂哦₂、血清、H₂哦₂和热灭活血清，或H₂哦₂和血清。虽然用H治疗₂哦₂或单独使用血清并没有显著降低TER，与H联合治疗₂哦₂血清确实导致TER恶化，在4小时内达到最大效果₂哦₂与单独的血清相比，血清导致TER显著下降₂哦₂和HI血清，或H₂哦₂当采用费希尔保护最小显著性差异（PLSD）进行分析时，单独使用。B类，用H处理细胞₂哦₂和血清或H₂哦₂和C7缺陷血清持续4小时。不能形成MAC的C7缺陷血清没有导致TER下降。重组C7恢复了血清降低TER的能力。C类，当细胞暴露于H₂哦₂和血清在其根尖上放置4小时(*Ap公司*)表面上，TER的下降幅度比暴露在基底层时更大(*文学士*)表面。D类在任何治疗条件下均未观察到ARPE-19细胞的TUNEL阳性染色，这表明这些治疗引起的TER下降不是由于细胞毒性。暴露于5 m米H（H）₂哦₂24小时作为TUNEL的阳性对照。数据表示为平均值±S.D(*误差线*)的*面板A–C*(n个=每种情况3–6）；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.

**图2。**
**氧化应激增加ARPE-19细胞表面的补体激活。**极化ARPE-19细胞用1m米H（H）₂哦₂流式细胞术检测氧化应激和表面C3b/d。A类，用C3多克隆抗体对未处理的细胞进行染色(填满)高于同型对照组(虚线). 用H处理的细胞₂哦₂表明C3b/d的表面水平较高(实线)而不是未经处理的细胞。B类、ARPE-19细胞暴露于血清(实线)经证明，表面C3b/d大于未经处理的对照(填满)，但氧化应激ARPE细胞(虚线)与未暴露于H的细胞相比，暴露于血清后的表面C3b/d更大₂哦₂。显示了至少三个独立实验的代表性结果，并对数据进行门控，以仅显示活细胞的结果。C类，用不同剂量的h处理细胞1小时₂哦₂清洗，然后暴露于血清中。上清液中C3的蛋白质印迹分析证实，暴露于氧化应激细胞后，血清中完整的C3（~185kDa）被更大程度地消耗。当用对照血清探测时，未发现低分子量条带，可能代表C3裂解片段或抗C3抗体与上清液中其他蛋白质的非特异性结合。D类，ELISA检测细胞上清液中C5b-9水平证实，当氧化应激细胞暴露于血清中时，补体被激活，MAC形成，而当未经处理的细胞暴露于血浆中时，则没有。*，第页< 0.05.

**图3。**
**氧化应激降低ARPE-19细胞DAF和CD59的表面表达。**DAF、MCP和CD59的ARPE-19细胞染色(填满)与同型对照染色相比，所有三种膜结合抑制剂的表面表达均得到证实(*灰色线条*). 选通仅用于检测活细胞。A类，用1m剂量处理细胞1h后，DAF的表面表达降低米H（H）₂哦₂.B类，MCP的表面表达没有改变。C类，CD59的表面表达在未分化细胞中呈双峰分布，高表达细胞的表面水平在H处理后降低₂哦₂。显示了至少三个独立实验的代表性结果。D类与未操作细胞的表面水平相比，氧化应激细胞的CD59和DAF水平分别降至61±4%和70±3%。E类，用H处理细胞₂哦₂对血清、表面DAF和C3b/d进行染色。表面DAF水平低的细胞比DAF水平高的细胞沉积C3b/d更多(n个=3用于D类和E类); *,第页< 0.001.

**图4。**
**DAF和CD59在ARPE-19细胞的顶端和基底外侧表面表达。**细胞在盖玻片上生长汇合。然后对其进行渗透和染色以进行DAF(A类)，CD59(B类)和Na⁺K（K）⁺-ATP酶(C类). DAF和CD59的最佳焦点视图显示了其在质膜中的顶端和基底外侧定位，三维重建证实了DAF和CD59与Na相比的顶端和基外侧浓度⁺K（K）⁺-ATP酶，已知其仅在顶端富集。

**图5。**
**血清中的H因子限制了未经处理的ARPE-19细胞表面的补体激活，但不限制氧化应激细胞的补体活化。**将ARPE-19细胞暴露于10%的血清中，添加或不添加50μg/ml的主要阴性形式的因子H(*rH-19–20*). 因子H是一种在正常血清中高浓度发现的替代途径抑制剂。A类当将rH-19-20添加到细胞中时，如果将其标准化为仅用血清获得的值，则会在细胞表面造成更大的沉积，这表明当细胞暴露于完整的补体系统时，因子H限制了细胞表面的补体激活。B类，当用H处理细胞时₂哦₂与单独血清相比，血清暴露导致C3b/d沉积增加2倍以上，但反应中添加rH-19-20并未导致表面C3b/d染色进一步显著增加。数据表示为平均值±S.D(*误差线*),n个=每种情况下为3。

**图6。**
**ARPE-19细胞上的补体激活可诱导VEGF的分泌，进而破坏屏障功能。**ARPE-19细胞作为单层生长，直到获得稳定的TER。A类，在根尖处理4小时后，去除根尖和基底上清液并分析VEGF含量。在基线检查时，VEGF的分泌呈两极分化，基底室的分泌增加。H（H）₂哦₂和血清单独对VEGF分泌没有一致的影响，而H₂哦₂+血清共同导致VEGF释放显著增加。与基底分泌物相比，这种增加表现出相反的极性，向心尖室的分泌物增加。H（H）₂哦₂+血清介导的VEGF释放可以通过阻断补体的替代途径（CR2-fH）或VEGF受体信号传导（SU5416）来抑制。当C7缺失血清用于氧化应激细胞时，VEGF不会分泌，但当C7耗尽血清与纯化的C7重新组合时，会分泌VEGF，这表明MAC的形成与这些细胞分泌VEGF.有关。数据表示为平均值±S.D(n个=每种情况3–6）。B类和C类，用H治疗₂哦₂4小时后，血清导致TER降低。联合应用CR2-fH（一种替代途径抑制剂），以及添加VEGF受体1/2拮抗剂（SU5416），可以阻止TER下降。统计比较指无治疗与H（H）₂哦₂+血清；和C7-缺失血清与去C7-血清加纯化C7.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.

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