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.2009年6月；40(6):2182-90.
doi:10.1116/中风A.108.523720。 Epub 2009年4月16日。

中风后急性血管破裂和水通道蛋白4丢失

贝斯·弗里德曼 1, 克里斯蒂安·沙赫特鲁普, Philbert S Tsai先生, 安迪·Y·施, 卡特琳娜·阿卡索格鲁, 大卫·克莱菲尔德, 帕特里克·D·莱登
附属公司

中风后急性血管破裂和水通道蛋白4丢失

贝斯·弗里德曼等。 (打、击等的)一下. 2009年6月.

摘要

背景和目的：水通道蛋白4（AQP4）表达缺陷的转基因小鼠中风发作面积的减小证明了缺血保护作用。然而，AQP4表型正常的动物在急性卒中期间是否会迅速降低，这一点尚不清楚，这可能是一种潜在的自我保护机制。

方法：成年雄性大鼠短暂阻断大脑中动脉（tMCAo）1至8小时，然后再灌注30分钟。Western blot和rtPCR检测AQP4和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的蛋白和mRNA表达。使用激光扫描细胞术（LSC）对Cy5标记的免疫反应以及血浆载高分子量荧光素-dextran病理摄取的荧光素信号进行荧光定量。用体内碘化丙锭（PI）细胞核标记评估细胞死亡。

结果：在缺血半球的组织切片中，在1至8小时的tMCAo后，荧光素-dextran摄取斑块与AQP4免疫反应性的局灶性丢失部位重叠。然而，在整个纹状体匀浆中测定的AQP4蛋白和mRNA的平均水平在tMCAo后8小时没有显著降低。在2小时或更长时间的tMCAo后，高荧光素摄取密度扫描区域的免疫反应性组织切片细胞术（LSC）显示AQP4降低，但IgG或GFAP没有降低。低密度荧光素抽提物的扫描区域没有丢失AQP4。在tMCAo 8小时后，只有1.7+/-0.85%（平均SD）的DAPI标记的细胞被PI和GFAP标记，因此星形胶质细胞稀疏死亡。

结论：在急性tMCAo期间，可发生存活星形胶质细胞AQP4免疫反应性的快速丧失。然而，AQP4的丢失具有空间选择性，主要发生在血管损伤区域。

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数字

图1
图1
tMCAo 1小时后AQP4免疫染色。左边的面板分别是Cy5-AQP4免疫反应性（左上）和病理性荧光素-Extran摄取（左中）的单个截面扫描图；左下角的面板显示了合并后的图像。中间面板是剖面视图，转换为灰度并反转以清晰显示。右侧面板以较高的放大率显示箭头处的区域。缺乏Aquaporin 4染色的苍白区域覆盖着一块密集的高分子量荧光素-右旋糖酐吸收区。
图2
图2
对持续时间为1、2、4或8小时的tMCAo患者的全脑切片进行AQP4免疫反应成像（左面板）和荧光素-Extran摄取成像（右面板）。缺血半球的纹状体显示苍白区域，AQP4降低。荧光素图像显示与高分子量荧光素-外分泌摄取重叠的区域。在缺血的新皮质中，tMCAo治疗8小时后，AQP4免疫反应出现周期性间断，并出现荧光素-外激素渗漏斑。对侧皮层保持正常、连续的AQP4染色模式。比例尺=1mm。
图3
图3
根据Western blot和rtPCR分析确定的tMCAo 8小时后整个缺血和对侧纹状体匀浆中AQP4 mRNA和蛋白的平均表达水平。（A） 8小时tMCAo（n=4）后，通过Western blot定量全缺血纹状体（I）和对侧纹状体的AQP4和GFAP蛋白。每条通道都装载了30μg蛋白质。通过归一化每个样品中的肌动蛋白水平来控制载荷变化。横条显示平均+/-SEM。相对于对侧，缺血纹状体中的AQP4或GFAP蛋白水平没有显著变化。（B） 8小时tMCAo后通过rtPCR对整个缺血和对侧纹状体和皮层AQP4和GFAP mRNA的定量（n=7）。基因表达数据按GAPDH标准化，并表示为相对于对侧纹状体或皮层的折叠变化（平均值±SE）。AQP4（ns）的杆高差异不显著。缺血纹状体和皮质中的GFAP mRNA显著高于对侧（ANOVA，p<0.005）。（C） 8小时tMCAo后微血管内荧光标记（绿色）和血管周AQP4染色（红色）的高分辨率图像。旋转视图（标记为X–Z）显示横截面中的血管；注意，血管壁荧光强烈，标记有荧光素-外分泌摄取、未标记的血管腔和血管周围AQP4。图像显示纹状体单个切片血管周围AQP4表达的异质性。
图4
图4
使用激光扫描细胞术（LSC）比较遮挡时间增加对荧光素-dextran联合标记的扫描区域频率和AQP4、IgG或GFAP免疫反应性的影响。（A1和A2）示出了脑切片，其在显微照片（A1）和伴随的LSC生成的该切片的数字化（A2）中显示了tMCAo 8小时后缺血半球中的荧光素-葡聚糖标记。（A3）用于量化荧光的直径为40μm的扫描区域的示例。该面板显示了一例患者在2小时tMCAo后血管摄取高分子量荧光素提取物导致的阳性扫描区域。（A4）LSC生成的散点图中，扫描区域的数据在整个截面上光栅化。每个象限提供四种不同计数类型中的一种的百分比区域：1。左上象限显示单标记Cy5免疫反应；2.右上象限显示荧光素-dextran和Cy5双重阳性的计数区域；3.右下象限显示用荧光素-dextran单标记的计数区域；4.左下象限展示了仅具有背景信号电平的计数区域。面板（F）中图形所示的整个截面的双标记指数是根据每个截面的总扫描面积的百分数（双阳性）来确定的（右上象限），然后将该值归一化为具有荧光标记的扫描面积的总和百分数（从右上和右下象限获得）（A5）荧光标记扫描区域密度随tMCAo闭塞时间的变化。在单个闭塞持续时间测定的病例数为：1小时tMCAo，n=5；2小时tMCAo，n=6；4小时tMCAo n=5；8小时tMCAo，n=5。用AQP4、IgG和GFAP对每个大脑前连合水平的不同切片进行免疫染色。对每个染色序列的1至2个切片进行LSC分析，以检测荧光素-外分泌的摄取，因此面板（A5）中显示的右旋糖酐密度指数代表每个闭塞持续时间16至19个切片的平均值。右旋糖酐密度指数是荧光素标记的扫描区域总数除以大脑切片的扫描区域总数量。荧光素-dextran摄取的面密度随着闭塞时间的延长而显著增加（1小时对4小时，p<0.05；1小时对8小时；p<0.001:ANOVA，然后进行Tukey检验）。（B） tMCAo 2小时后，在一个大脑的50μm切片中，免疫染色图像与荧光素标记融合。截面位于1 mm厚的块内。（B1）荧光素-右旋糖酐摄取集中在微血管段之间。（B2）较高放大倍数的插图（B1中的白色方框）显示不同口径受影响血管的标记强度不均匀。（C1）荧光素-dextran标记的血管系统（绿色，带黄绿色边界）和AQP4免疫反应性（红色）的荧光融合图像。（C2）插入面板显示血管重叠，血管内荧光物质摄取（绿色）和血管周AQP4标记血管重叠，在荧光物质泄漏的血管附近为黄色，或在未标记荧光物质的血管附近呈红色。（D1）荧光素抽提物标记的血管系统和IgG漏出的合并图像（红色）。（D2）合并图像的高倍放大显示荧光素-dextran荧光和Cy5-IgG免疫反应几乎完全重叠（黄色）。该部分与面板B1和B2中显示的相同，其中荧光素-Extran荧光显示为绿色。荧光素-右旋糖酐标记的血管也被Cy5-IgG免疫反应所包围，这与中风后IgG广泛外渗相一致。（E1）荧光素-dextran标记的血管（绿色）和GFAP免疫反应性（红色）的荧光融合图像。（E2）荧光素-右旋糖酐标记的血管与GFAP染色的星形胶质细胞密布。（F） 比较封闭时间延长对全脑切片扫描区域AQP4、IgG和GFAP的荧光素-dextran和Cy5标记免疫反应性共同标记的影响。与tMCAo 1小时后的AQP4双标记指数相比，tMCAo2、4和8小时后的AQP4双标指数显著降低。相反，tMCAo 1小时后，IgG和GFAP双标记指数没有下降。在每个闭塞持续时间内，从5至6个截面（每个大鼠大脑1至2个截面）获得双标签指数数据。
图5
图5
用LSC定量的AQP4在摄入高分子量荧光素-右旋糖酐最少的脑区的免疫反应性。（A） tMCAo治疗1小时和4小时后，大脑缺血侧和对侧具有低水平荧光素-葡聚糖信号的区域显示出相似水平的AQP4免疫反应性。在这些图像中，较大的血管比微血管网络染色更密集。在tMCAo后8小时，低荧光素-外显子区域的染色更加不均匀，相对于对侧，AQP4免疫反应性降低和升高的区域。8小时图像中的卵圆形结构是有髓纤维簇，通常表现出很少的AQP4免疫反应性（例如，图2中还显示了稀疏染色的白质束）。（B） 激光扫描细胞术（LSC）通过操作员定义的亚区光栅化扫描定量组织荧光，该亚区包括低或高水平荧光素-dextran信号区域中约300个扫描区域（参见方法）。y轴表示荧光素信号的扫描区域数除以该子区域的扫描区域总数。低水平和高水平荧光素右旋糖酐的亚区在脑切片中被操作员分割。总荧光测量数据取自每个闭塞持续时间的5至6个截面（每个大鼠大脑1至2个截面）。（C） 操作员定义的子区域中AQP4 Cy5信号的量化。y轴绘制Cy5标签的扫描区域数除以该子区域的扫描区域总数。AQP4染色在高漏失区逐渐消失，但在缺血半球或对侧半球的低漏失区无进展（重复测量ANOVA，p<0.02）。
图6
图6
通过体内循环碘化丙啶的摄取来确定急性中风诱导的细胞死亡。显示了一个字段的一系列图像。面板A1和A2显示缺血纹状体中DAPI染色的细胞核（A1中），以及由于死亡细胞（A2中）的质膜通透性屏障丧失而导致PI核摄取的相应分布。合并后的图像（白色箭头）显示DAPI和PI重叠处的白色光晕。图B1和图B2显示了由PI（箭头）共同标记的细胞和相邻的PI阴性细胞（双箭头）的GFAP免疫反应性。（C） 与碘化丙啶或GFAP共标记的细胞比例饼图（DAPI阳性）。右侧的放大图描绘了GFAP联合标记的碘化丙啶阳性细胞的比例（棕褐色部分）。数据基于每只大鼠大脑（n=3）在缺血纹状体60倍成像区域的2个切片。每只大鼠大脑中DAPI细胞计数为594、566和678个。
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