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.2009年6月3日；28(11):1589-600.
doi:10.1038/emboj.2009.89。 Epub 2009年4月9日。

SLP-2是应激诱导线粒体过度融合所必需的

丹尼尔·通德拉 1, 圣埃芬妮·格兰德曼奇, 亚历克西斯·朱丹, 马吕斯·卡博夫斯基, 伊夫·马滕伯格, 塞巴斯蒂安·赫齐格, 桑德琳·达克鲁斯, 帕斯卡琳·克莱尔, 伊内斯·拉什克, 卡斯滕·默克维思, 莎拉·埃希斯, 弗兰克·克劳斯, 大卫·C·陈, 克里斯蒂安·亚历山大, 克里斯托夫·鲍尔, 理查德·尤尔, 兰格尔, Jean-Claude马蒂诺
附属公司

SLP-2是应激诱导线粒体过度融合所必需的

丹尼尔·通德拉等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

线粒体是动态的细胞器，其形态是融合和分裂这两个对立过程的平衡结果。线粒体融合依赖于动力相关的GTPases、线粒体外膜中的线粒体融合蛋白（MFN1和2）和线粒体内膜中的OPA1（视神经萎缩1）。除了线粒体DNA的维持作用外，对线粒体融合的生理作用知之甚少。在这里，我们报道了线粒体过度融合并在暴露于选择性应激的细胞中形成高度互联的网络。当受到凋亡刺激（如紫外线照射或放线菌素D）触发时，此过程先于线粒体分裂。应激诱导的线粒体过度融合（SIMH）独立于MFN2、BAX/BAK和抑制剂，但需要L-OPA1、MFN1和线粒体内膜蛋白SLP-2。在没有SLP-2的情况下，L-OPA1丢失，SIMH被阻止。SIMH伴随着线粒体ATP生成的增加，是一种新的适应应激的生存反应。

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数字

图1
图1
应对应激刺激的线粒体微管需要Opa1和Mfn1。(一个,B类)暴露于60mJ/cm后的野生型MEFs2UV-C，3μg/ml Act D或10μM CHX。（A） 用细胞色素抗体染色的MEFc（c）在未经处理的条件下和应激暴露后9h用荧光显微镜进行分析。比例尺，25μm。（B） 在压力暴露后的指定时间点，对大多数连接的、很长（>5μm）的管状线粒体的细胞进行量化，这些线粒体的末端难以观察（定义为过度融合线粒体）。数据表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。(C类,D类)野生型，Mfn1−/−，百万分之二−/−，Mfn1/2−/−、Opa1−/−和Bax/Bak−/−暴露于UV-C照射后的MEF。（C） 暴露于60 mJ/cm后9 h线粒体过度融合细胞的定量2UV-C、3μg/ml Act D或10μM CHX。数据表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。此处显示的野生型MEF是Mfn1的控件−/−细胞和是所有WT MEF的代表，用作突变MEF的对照。（D） 用细胞色素抗体染色的MEFc（c）在未处理的条件下和UV-C照射后9小时通过荧光显微镜进行分析。比例尺，25μm。
图2
图2
SIMH是线粒体融合活性增加的结果。(一个)可视化和(B类)使用mito-PAGFP定量二甲基亚砜处理的Mfn2中线粒体融合−/−MEF（UT单元）(n个=27），以及Mfn2−/−MEFs 3小时(n个=30）和7小时(n个=30）CHX治疗后。用405-nm的光对有丝分裂-PAGFP表达细胞内的感兴趣区域进行光激活，然后用488-nm的光进行全细胞成像。用较高的探测器增益拍摄激活前图像，激活后调整增益以避免激活线粒体过饱和。采集后处理使用MetaMorph软件进行。数据表示平均值±标准误差。P（P）-值（与未经处理的Mfn2相比−/−),t吨-测试，双尾，未配对。(C类)野生型Mfn1线粒体的形态−/−，Mfn2−/−，Mfn1/2−/−、和Opa1−/−MEF瞬时表达显性阴性DRP1突变体HA-DRP1-K38。使用MitoTracker对线粒体进行染色，使用HA标签抗体显示Drp1 K38A。(D类)（C）中描述的线粒体形态细长的细胞定量。作为对照，细胞转染GFP。数据表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。(E类)未经处理的WT MEF和暴露于60 mJ/cm后的亚细胞分馏2UV-C、3μg/ml ActD或10μM CHX。在指定的时间点采集细胞并分离线粒体。分别使用DRP1和FIS1抗体通过SDS-PAGE分析细胞质和线粒体部分。肌动蛋白作为细胞质部分的负荷控制。这些数据代表了三个独立的实验。**P（P）<0.01;***P（P）<0.005; 学生t吨-测试，未配对，双尾。
图3
图3
应激诱导的线粒体过度融合需要SLP-2。(一个)暴露于60mJ/cm后8小时稳定表达抗萤光素酶对照shRNA（shLuc）或抗SLP-2 shRNA（shSLP-2）的野生型MEFs中线粒体形态的定量2UV-C或10μM CHX。管状线粒体是指游离端可见的孤立线粒体；过度融合的线粒体形成了一个由相互连接的细胞器组成的网状结构，其末端难以观察。(B类)CHX治疗后指定时间点对（A）中所述细胞进行免疫印迹分析。使用OPA1和SLP-2抗体通过SDS-PAGE分析全细胞裂解产物。(C类)瞬时转染FLAG标记的大鼠OPA1变异体1（rOPA1-V1）及其不可切割缺失突变体（rOPA1-V1-ΔS1）后，稳定表达shSLP-2的野生型MEF线粒体形态定量。细胞暴露于10μM CHX 8h后，用MitoTracker和FLAG抗体进行染色，并用荧光显微镜分析转染细胞的线粒体形态。(D类)（C）中所述细胞的免疫印迹分析。使用OPA1和SLP-2抗体通过SDS-PAGE分析全细胞裂解产物。HSP70用作负载控制（B、D）。数据（A，C）表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。印迹（B，D）是三个独立实验的代表。
图4
图4
SLP-2可防止SIMH期间OPA1蛋白水解。(一个)Opa1的免疫印迹分析−/−在CHX治疗后的指定时间点，短暂转染FLAG标记的大鼠OPA1变异体1（rOPA1-V1）及其非切割缺失突变体（rOPA1-V1-ΔS1）后，MEF稳定表达shSLP-2或shLuc。使用OPA1抗体通过SDS-PAGE分析全细胞裂解产物。(B类)Opa1中线粒体形态的定量−/−线粒体靶向YFP单独（未显示）或与rOPA1-V1和rOPA1-V1-ΔS1一起瞬时转染后，MEF稳定表达shLuc或shSLP-2。细胞暴露于10μM CHX中8 h，并通过荧光显微镜分析YFP阳性细胞(C类). (D类)稳定表达抗荧光素酶shRNA（shLuc）或SLP-2（shSLP-2）的野生型MEF用指示浓度（1,10）处理-o个-菲咯啉或1 mM PMSF单独或与10μM CHX联合使用。3小时后，收集细胞并使用全细胞裂解物进行SDS-PAGE。(E类)Pbh2的线粒体形态飞行/飞行MEFs（WT）、Prohibitin 2敲除（Phb2−/−)和Phb2−/−再次表达禁止蛋白2（PHB2｜PHB2−/−)暴露于10μM CHX后6小时。(F类)（E）中所示的细胞数量。HSP70用作负载控制（a、D）。数据（B）表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。
图5
图5
SIMH促进线粒体ATP生成。(一个,B类)用Act D（3μM）、CHX（10μM）、UV（60 mJ/cm）处理的WT MEFs中总ATP水平的测量2)和STS（0.25μM）（A），符合SIMH标准（WT，Mfn2−/−，shLuc）和不称职（Mfn1−/−，OPA1−/−，shSLP-2）细胞（B）暴露于10μM CHX处理6 h(C类–E类)线粒体ATP生成的测量。用10μM CHX预处理细胞6 h，然后用10 mM甲基丙酮酸（MeP）。在5、10或15分钟后采集细胞，并测定总ATP水平。在联合添加甲基丙酮酸+寡霉素（10μM）15分钟后，也测量了In（C）ATP水平。数据表示至少三个独立实验的平均值±s.e.m。*P（P）<0.05；**P（P）<0.01;***P（P）<0.005; 学生t吨-测试，未配对，双尾。
图6
图6
SIMH与超微结构改变有关。WT、Mfn1的超微结构分析−/−，hMFN1-HA：Mfn1−/−，OPA1−/−，mOPA1-V1:OPA1−/−、shLuc和shSLP-2 MEF。细胞未经处理（左侧）或暴露于10μM CHX（右侧），并在6小时后固定，以进行电子显微镜分析。比例尺，1μm。
图7
图7
应激诱导的线粒体过度融合可防止细胞凋亡。(一个)Mfn1死亡−/−和hMFN1-HA:Mfn1−/−暴露于3μg/ml Act D或60 mJ/cm的细胞2紫外线-C(B类)瞬时转染shSLP-2或shLuc的HeLa和MEF细胞暴露于60 mJ/cm后死亡2紫外线-C(C类)Mfn1死亡−/−和hMFN1-HA:Mfn1−/−MEF细胞暴露于1μM staurosporine。在所有病例中，在指定的时间点采集细胞，并用膜联蛋白V FITC染色以进行流式细胞仪分析。数据表示至少三个独立实验的平均值±s.e.m(*P（P）<0.05；**P（P）<0.01）。
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中的注释

  • 糊状线粒体在压力下融合。
    范德布利克上午。 范德布利克上午。 EMBO J.2009年6月3日；28(11):1533-4. doi:10.1038/emboj.2009.130。 EMBO J.2009年。 PMID：19494844 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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