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.2009;4（4）：e5105。
doi:10.1371/journal.pone.0005105。 Epub 2009年4月2日。

HD-PTP是一种无催化活性的酪氨酸磷酸酶，因为其磷酸酶结构域存在保守的差异

玛丽·克劳德·金格斯1, 张玉玲, 德米特里·卡里蒂迪, 阿拉斯泰尔·巴尔, 斯特凡·纳普, 米歇尔·特伦布雷, Arnim暂停
附属公司

HD-PTP是一种无催化活性的酪氨酸磷酸酶，因为其磷酸酶结构域存在保守的差异

玛丽·克劳德·金格斯等。 公共科学图书馆一号. 2009.

摘要

背景：HD-PTP蛋白被描述为肿瘤抑制候选物，根据其氨基酸序列被归类为经典的非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）。迄今为止，还没有发现HD-PTP磷酸化底物，最近报道了关于其催化活性的有争议的结果。

方法和结果：在这里，我们报告了一项严格的酶分析，证明HD-PTP蛋白不含酪氨酸磷酸酶或脂类磷酸酶活性，使用高度敏感的DiFMUP底物和一组不同的磷脂酰肌醇磷酸盐。我们发现，HD-PTP酪氨酸磷酸酶失活是由位于HD-PTP磷酸酶结构域中的一个关键残基的进化保守氨基酸分歧引起的，因为其后突变足以恢复HD-PTP的酪氨酸磷酸酯活性。此外，HD-PTP的表达与肿瘤抑制活性一致，导致人类癌细胞株中的集落生长减少，与其催化PTP活性状态无关。

结论：总之，我们证明HD-PTP是一种无催化活性的蛋白酪氨酸磷酸酶。因此，我们确定了一个参与其灭活的残基，并表明其集落生长抑制活性与其在人类肿瘤细胞系中的PTP活性状态无关。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。HD-PTP无催化活性。
A） 在HEK 293T细胞中表达Flag-HD-PTP催化域（CD）或全长蛋白（HD）野生型（WT）或C1392S（C/S）或相应的空载体（EV），并通过考马斯染色和抗Flag抗体的western blot分析进行纯化和可视化。B）使用DiFMUP底物进行HD-PTP磷酸酶活性测定，显示了水解DiFMU荧光发射的典型时间过程动力学曲线。C）反应的平均速度（速率）由动力学曲线导出，表示为每分钟DiFMU的pmole（pmole/min）。结果表示三个独立实验的平均值（+/-SD）。
图2
图2。S1394A突变恢复HD-PTP催化活性。
A） PTP基序9与HD-PTP序列的一致性比对显示了物种间保守的氨基酸差异（人类氨基酸1394是丝氨酸而不是丙氨酸；装箱）。指出了必需的催化半胱氨酸残基（C）。B）纯化的HD-PTP（CD）或全长蛋白（HD）、野生型（WT）或S1394A（S/A）的催化结构域通过考马斯染色和免疫印迹显示。如图1所示，在pH 6.5（C，D）或pH值为4至8.5（D，E）的条件下进行C–F磷酸酶分析。C，E）水解DiFMU荧光发射的典型时间过程动力学曲线。D，F）反应的平均速度（速率）由动力学曲线得出，结果代表三个独立实验的平均值（+/−SD）。
图3
图3。抑制HD-PTP S/A活性。
A） 用于C和D的PTP1B的GST标记催化域在细菌中表达并按所述进行纯化。重组蛋白的完整性和纯度通过考马斯染色和抗GST抗体的western blot分析显示。B）如前所述表达、纯化和可视化带有S1394A（S/A）的标记HD-PTP催化域（CD）或全长（HD）蛋白，或与C1392S（C/S）突变结合或不结合。C，D）酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠（Van）的作用对HD-PTP催化域S1394A突变株（CD-S/A）进行了检测。PTP1B被用作抑制剂的对照。E，F）如图1所示，使用DiFMUP磷酸酶分析法检测C1392S突变对HD-PTP催化结构域或全长S1392A突变活性的影响。显示了从三个独立实验（+/−SD）（D，F）得出的代表性动力学曲线（C，E）和平均反应速率。
图4
图4。HD-PTP没有脂质磷酸酶活性。
HD-PTP磷酸酶对合成磷脂酰肌醇磷酸盐底物的活性通过孔雀石绿基分析进行评估。HD-PTP野生型（WT）、C1392S（C/S）或S1394A（S/A）的催化域（CD）与PI（3,4,5）P（A）、PI（3,14）P（B）、PI。以PTEN野生型（WT）和C132S（C/S）纯化蛋白为对照。结果表示三个独立实验的平均值（+/-SD）。
图5
图5。HD-PTP可独立于其磷酸酶活性状态减少菌落生长形成。
对肾细胞癌细胞系（ACHN和786-0）进行集落形成分析，转染含有新霉素耐药基因或表达Flag-HD-PTP构建物的空载体（EV）。蛋白表达水平通过western blot分析，使用抗Flag抗体和抗肌动蛋白抗体作为负荷对照（a）。B）G418选择2周后获得的菌落进行固定、染色和计数。结果表示为相对于EV条件的菌落数，并表示独立实验的平均值（+/-SD），（786-0:n = 4,ACHN:n个 = 5). 十： 未转染细胞。
图6
图6。HD-PTP催化域模型。
A） HD-PTP同源性模型基于PTP1B底物复合物的结构（pdb-code:1g1h）。HD-PTP残留物分别用黑色和PTP1B残留物用灰色标记。显示了已知在PTP底物识别和催化中起关键作用的保守残基，这些残基在HD-PTP中发生了改变。B–C）与两个磷酸残基相关的PTP1B活性位点的表面表征（B）和与一个磷酸相关的HD-PTP蛋白的预测（C）。
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工具书类

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