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.2009年5月；6（5）：363-9。
doi:10.1038/nmeth.1323。 Epub 2009年3月31日。

利用piggyBac转座子产生无转基因诱导的多能干细胞

Kosuke Yusa公司 1, 罗兰·拉德, 武田俊二, 艾伦·布拉德利
附属公司

利用piggyBac转座子产生无转基因诱导的多能干细胞

Kosuke Yusa公司等。 Nat方法. 2009年5月.

摘要

通过转基因表达Oct4（Pou5f1）、Sox2、Klf4和Myc，从体细胞中产生了诱导多能干细胞（iPSCs）。然而，将这项技术应用于再生医学的一个主要困难是重新编程因子的传递。尽管逆转录病毒转导增加了致瘤性风险，但瞬时表达方法的重编程效率要低得多。在这里，我们描述了一种高效的基于piggyBac转座子的方法来生成无集成iPSC。携带2A肽链重编程因子的转座子诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程，其效率与逆转录病毒转导相当。我们通过转座酶的重新表达从这些初级iPSC中移除转座子。不含转基因的iPSC可以通过阴性选择进行鉴定。piggyBac切除时没有足迹，iPSC基因组没有任何基因改变。iPSCs符合多能性的所有标准，如多能性基因表达、畸胎瘤形成和嵌合体的贡献。基于piggyBac转座子的重编程可用于生成治疗上适用的iPSC。

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数字

图1
图1。piggyBac转座子介导的重编程载体的构建
(一)的示意图猪背肉转座子。四个或五个因子通过2A肽连接。这些因子的表达由组成活性CAG启动子驱动。牛生长激素多聚腺苷化信号；聚氨酯Δtk公司，PGK发起人驱动聚氨基甲酸酯Δtk公司表达盒；PB5′和PB3′猪背肉转座子。(b条)2A肽介导的重编程因子表达的Western blot分析。每个面板（个体）最左边的通道是使用未链接因子表达载体的阳性对照转染。“−”，使用eGFP表达载体进行阴性对照转染。
图2
图2。利用piggyBac转座子产生初级iPSC
(一)转座子介导的重新编程的时间表。胚胎成纤维细胞培养基；F15L，基于血清的ESC培养基；K15L，无血清ESC培养基。三角形，中等变化。(b条)第14天菌落的碱性磷酸酶染色。‘−’，使用eGFP表达载体进行阴性对照转染。(c（c）)经过（底部）和（顶部）VPA处理的AP染色菌落的放大图。(d日)在第14天进行（底部）和（顶部）VPA处理的Nanog免疫染色。左，相位对比；对，抗Nanog免疫染色。(e（电子）)通过基于转座子的重编程获得的菌落数量。OSKM*与OSKM相同，只是Sox2和Klf4通过F2A而不是T2A连接。(（f）)转座子拷贝数分布取决于转座子质粒数量。OSKM*载体用于2.0μg和0.50μg的转染，OSKML载体用于0.25μg转染。***在实验中仅鉴定出一个单拷贝转座子iPS集落。数据显示为平均值±标准差。每个条件下至少进行3次实验。**，第页<0.05（学生的t吨测试）。比例尺，5 mm(b条)，100微米(c、 d日)
图3
图3。从已建立的iPSC系中去除转座子
(一)转座子移除示意图。之后猪背肉转座酶转染，转座子不转座或不移动到其他基因座的细胞对FIAU敏感，而转座子在其他地方不重新整合的细胞则具有FIAU抗性。(b条-e（电子）)Southern杂交分析显示无转座子iPSC系的证据(b条)和基因组PCR(c（c）-e（电子）). (b条)猪背肉以转座子5′重复序列为探针。亲本iPSC系有2个转座子整合拷贝（iPS25、28和216）。请注意，在Hin公司iPS28的dIII消化，两个片段大小相似，迁移位置相同（另请参见补充图3d）。FIAU抗性亚克隆（命名为Δ）没有任何转座子。用控制探针重新混合印迹，以显示相等的样品负载。(c（c）-e（电子）)设计特异性引物检测单个转座子整合位点。MEF和每个初级iPSC克隆分别作为阴性和阳性对照。(（f）,克)iPS28衍生克隆中转座子切除后原始序列完全恢复的证据。顶部面板是原始基因组序列。中间的面板显示转座子整合位点，其中TTAA序列在转座子的两端重复。底部面板中的电泳图显示，iPS28衍生克隆在切除后的序列与MEF中的原始序列相同。chr.6上的集成站点1(（f）)和chr.15上的站点2(克)如图所示。
图4
图4。无整合iPSC的特性
(一)无整合iPSC系iPS25Δ1的正常核型。(b条)无整合iPSC系的RT-PCR分析与ESCs表达的比较。(c（c）)无整合iPSCs中Oct4和Nanog表达的免疫荧光分析。(d日)的启动子区的亚硫酸氢钠测序10月4日和纳克开环和闭环分别表示未甲基化和甲基化的CpG二核苷酸。(e（电子）)无融合iPSC产生的畸胎瘤，显示出对所有三个胚层的分化。比例尺，100μm
图5
图5。无整合iPSCs对嵌合体体细胞组织和生殖系的贡献
(a、 b条)10.5 d.p.c.时的嵌合胚胎(一)和出生后第5天的幼崽(b条)来源于具有组成型eGFP表达的无整合iPSC。GFP图像显示在底部。(c（c）)来自Nanog-GFP敲除iPSCs的e12.5胚胎的性腺发育。GFP图像如下所示。虚线勾勒出性腺的轮廓。比例尺，1 mm(一)，5毫米(b条)，200微米(c（c）)
图6
图6。生成无转基因iPSC的方案
方案A（黑色箭头）：转座子和转座酶DNA转染MEF以产生原代iPSC后，通过Southern blot分析，挑选单个iPSC菌落，用2拷贝转座子整合鉴定菌落。这些克隆随后被扩增，转座酶被重新表达以去除转座子。HSVtk公司-FIAU阴性选择用于识别无集成iPSC。方案B（红色箭头）：使用优化的协议，可以绕过对单个克隆的分析。初级iPSC可以合并，并直接进行转座子移除和HSVtk公司-FIAU选择。
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中的注释

  • 没有痕迹？PiggyBac-ing走向多能性。
    Stadtfeld M，Hochedlinger K。 Stadtfeld M等人。 自然方法。2009年5月；6(5):329-30. doi:10.1038/nmeth0509-329。 自然方法。2009 PMID：19404251 没有可用的摘要。

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    Ross PJ、Suhr ST、Rodriguez RM、Chang EA、Wang K、Siripatarapravat K、Ko T、Cibelli JB。 Ross PJ等人。 干细胞开发，2010年8月；19（8）：1221-9。doi:10.1089/scd.2009.0459。 干细胞开发，2010年。 PMID：20030562
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    Stadtfeld M、Nagaya M、Utikal J、Weir G、Hochedlinger K。 Stadtfeld M等人。 科学。2008年11月7日；322(5903):945-9. doi:10.1126/science.1162494。Epub 2008年9月25日。 科学。2008 PMID：18818365 免费PMC文章。
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    Singh VK、Kumar N、Kalsan M、Saini A、Chandra R。 Singh VK等人。 干细胞杂志。2015;10(1):43-62. 干细胞杂志。2015 PMID：26665937 审查。
  • 干细胞生物学的基因组编辑工具。
    Vasileva EA、Shuvalov OU、Garabadgiu AV、Melino G、Barlev NA。 Vasileva EA等人。 细胞死亡疾病。2015年7月23日；6（7）：e1831。doi:10.1038/cddis.2015.167。 细胞死亡疾病。2015 PMID：26203860 免费PMC文章。 审查。
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