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.2009;4（3）：e4998。
doi:10.1371/journal.pone.0004998。 Epub 2009年3月24日。

MicroRNA-199b-5p通过对髓母细胞瘤中HES1的负调控损害肿瘤干细胞

利维亚·加齐亚 1, 安道夫Immacolata, 埃米利奥·库萨内利, 纳塔西亚·马里诺, 朱塞佩·彼得罗西诺, 丹妮拉·德·马蒂诺, 维罗妮卡·埃斯波西托, 阿尔多·盖隆, 路易吉·纳瓦斯, 西尔维娅·埃斯波西托, 萨拉·加吉洛, 莎拉·法特特, 维多利亚·多诺弗里奥, 朱塞佩·西纳利, 阿图罗·布鲁内蒂, 路易吉·德尔·维奇奥, 保罗·A·诺斯科特, 奥利维尔·特拉特, 迈克尔·D·泰勒, 阿基利·伊奥拉斯康（Achille Iolascon）, 马西莫·佐洛
附属机构

MicroRNA-199b-5p通过对髓母细胞瘤中HES1的负调控损害肿瘤干细胞

利维亚·加齐亚等。 公共科学图书馆一号. 2009.

摘要

背景：通过对基因表达的负调控，microRNAs（miRNAs）可以作为抑癌基因在癌症中发挥作用，并且可以在各种肿瘤类型中显示出改变的表达。在这里，我们研究了髓母细胞瘤肿瘤（MBs），它起源于小脑发育过程的早期损害，其中Notch信号参与了许多细胞-日期决定阶段。MBs以双峰方式出现，发病高峰出现在3-4岁至8-9岁之间，但也可能发生在成年人中。Notch调节具有干细胞样特性并能促进肿瘤生长的MB细胞亚群。基于这一证据，我们假设靶向Notch通路的miRNAs可以调节这些现象，并可用于抗癌治疗。

方法/主要发现：在MB细胞系的筛选中，miRNA miR-199b-5p通过靶向转录因子HES1被视为Notch通路的调节器。miR-199b-5p下调HES1表达对MB细胞的增殖率和锚定非依赖性生长具有负调节作用。MiR-199b-5p过表达阻断了几种癌症干细胞基因的表达，损害了MB细胞在裸鼠/裸鼠小脑中的植入潜力，特别值得注意的是，减少了MB干细胞样（CD133+）细胞亚群。在我们对61例MB患者的分析中，miR-199b-5p在非转移性患者中的表达显著高于转移性患者（P=0.001）。miR-199b高表达患者的生存率与生存率的相关性表明，与低表达患者相比，这些患者的总体生存率更高。这些数据显示miR-199b-5p在转移性MBs中的下调，这表明通过表观遗传学或遗传改变存在潜在的沉默机制。在使用5-氮杂脱氧胞苷诱导去甲基化后，在一组MB细胞系中观察到较低的miR-199b-5p表达，支持表观遗传调控机制。此外，两个细胞系（Med8a和UW228）在治疗后显示miR-199b-5p显著上调。小鼠小脑诱导异种移植模型中的MB细胞感染和携带miR-199b-5p的腺病毒的使用表明，通过miR-199b-5p对肿瘤生长和MB干细胞样细胞亚群的负面影响，临床受益，进一步证明了这一概念。

结论/意义：尽管我们对MB发病机制的认识有所进步，但其中三分之一的患者仍然无法治愈，目前的治疗方法可能会严重损害长期存活的患者。在此，我们发现miR-199b-5p的表达与转移扩散相关，从而为MB患者的低风险等级确定了一个新的分子标记。我们进一步表明，在异种移植模型中，MB肿瘤负担可以降低，这表明术后使用miR199b-5p作为辅助治疗，结合放射和化疗，以改善抗癌MB治疗和患者的生活质量。到目前为止，这是第一份miRNA表达可以耗尽肿瘤干细胞的报告，这表明在脑肿瘤中靶向这些细胞是一种有趣的治疗方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。体外miR199b-5b对Daoy MB细胞增殖和分化的作用。
A） 用丙碘进行的典型FACS分析显示，稳定的199bSC1克隆的S期细胞百分比下降，G0-G1增加。在199bSC1和199bMC1克隆中不存在具有G0-G1红峰的肩部信号排除了凋亡过程。B） 用3-4,5-二甲基噻唑-2-基-5-3-羧甲基氧基苯基-2-4-磺苯基-2H-四唑盐（MTS）进行的增殖试验表明，与单独使用空载体的稳定克隆（蓝色菱形）相比，稳定的199bSC1克隆（红色三角形）和199bMC1克隆（绿色交叉）的增殖率降低。通过2-OM转染（粉红色方块）可降低miR-199b-5p过度表达的影响。所示数据为两个独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份。C） 实时PCR显示miR-199b-5p过度表达时分化（如MASH1、MATH3和神经原蛋白2）和增殖（如C-MYC、CYCLIN D1）标记的代表性mRNA表达，比较稳定的199bSC1和199bMC1克隆与空载体克隆。D） miR-199b-5p的稳定199bSC1克隆在软琼脂分析中显示菌落形成受损。图中显示了三个独立实验中以平均值±标准偏差计算的菌落，每个实验均进行了三次。E） 使用抗c-Myc和抗cyclin D1抗体的代表性Western blot显示，这两种蛋白在稳定的199bSC1克隆中下调；另请参阅右侧面板中的密度分析。F） 至于E，显示miR-199b表达后GABRA6和MATH3蛋白上调，提示分化诱导。抗层粘连蛋白-β抗体用于使细胞核c-Myc和细胞周期蛋白D1的表达正常化。抗β-肌动蛋白抗体用于规范化胞质GABRA6和MATH3蛋白表达。
图2
图2。miR-199b-5p的过度表达降低了Daoy细胞的CD133+室。
A–F）对稳定的199bSC1（D）和199bMC1（F）克隆的代表性FACS分析显示，对干细胞标记CD133（B）阳性的细胞百分比减少；A、 C和E为阴性对照（无抗体）。
图3
图3。HES1转染可逆转miR-199b-5p过度表达的影响。
A） 典型的Western blot和密度分析表明，通过在稳定的199bSC1克隆中过度表达HES1 cDNA来拯救HES1表达，可以恢复cyclin D1的表达。B） 用3-4,5-二甲基噻唑-2-基-5-3-羧甲基氧基苯基-2-4-磺苯基-2H-四唑盐（MTS）进行的增殖试验表明，与单独的稳定199bSC1克隆（浅蓝色钻石）相比，HES1表达的稳定199b SC1克隆的增殖率增加（深蓝色方块）。所示数据为两个独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份。C） 如实时PCR所揭示的，在稳定的199bSC1克隆中，与野生型细胞相比，在用HES1拯救细胞时，分化（例如MASH1、MATH3和神经原蛋白2）和增殖（例如C-MYC、CYCLIN D1）标记物的Rapresentative mRNA表达。在救援实验中，GABRA 6和MAP2的表达下调。D） 对表达HES1的稳定199bSC1克隆的代表性FACS分析显示，相对于单独的稳定199b SC1克隆，S期细胞比例增加，G1期细胞比例减少。E–H）miR-199b-5p表达对Daoy细胞SP的影响被HES1的重新表达所逆转。用HES1 cDNA和GFP编码质粒转染199bSC1稳定克隆，48小时后用Hoechst和维拉帕米（E–F）或单独用Hoechost（G–H）处理，并进行FACS分析。分析GFP阳性细胞（P5门），面板E和G是否存在染料排除细胞（F–H，P6门）。未转染GFP阴性细胞（P3门）未进行分析。
图4
图4。过度表达miR-199b-5p的Daoy细胞的致瘤性降低。
A） 在五只小鼠皮下注射对照Daoy细胞（CTR侧）和过度表达miR-199b-5p的Daoy电池（199b侧）后，进行为期九周的异种移植实验。使用CTR细胞，5/5小鼠肉眼可见肿瘤；在3/5小鼠中具有过表达细胞。生长9周后，CTR和199b注射侧的肿瘤总体积差异具有统计学意义（平均值±标准偏差）。B） 肿瘤生长九周后小鼠#4的光子发射。199b侧（199bLuc-1）的光子发射始终低于对照侧（Ctl-Luc-4）。还显示了肿瘤尺寸的比较。C） 当光子发射（参见B）转换为细胞数时；五只小鼠中有一只表现出无显著差异（平均值±SD）（双尾未配对吨测试）。D） 第四脑室注射3只小鼠的光子发射，分别为199bLuc-1、Ctl-Luc-4感染模拟AdV5和Ctl-Loc-4感染miR-199b-5p AdV5。E） 动物的整个大脑和注射部位（白色箭头）。小脑苏木精/伊红染色；黑箭头，肿瘤发生的起始位点。F） 肿瘤生长一个月后，注射小鼠的BLI与D相同。两组之间的差异具有统计学意义。G） 两个选定小鼠的BLI显示，随着时间的推移（0-8周），Ctl-luc4-AdV5-Mock#7的肿瘤负荷增加，而Ctl-lug4-AdV5-199b#3的肿瘤负荷减少。H） 原位注射后10周，对AdV5-Mock#2和AdV5-199b#3动物的小脑进行苏木精-伊红染色，显示外颗粒层周围和IV心室内的肿瘤细胞（白色星形）。蓝色，DAPY染色，结合GFP检测。放大倍数如图所示。
图5
图5。注射到小脑的异种移植MB细胞的高分辨率分子成像。
手术和注射后12周，AdV5-Mock#7（A）和AdV5-199b#5（B）小鼠的PET-CT融合图像，具有3D容积渲染和同时显示FLT摄取区域（蓝色-绿色，白色箭头）。AdV5-Mock#7小鼠的颅骨枕顶骨部分存在较宽的骨缺损。下表：测量表（cm三)通过PET-CT采集的肿瘤肿块（如文本S1所述）。
图6
图6。miR199b在人小脑和肿瘤中的表达水平及其与预后的关系。
A） 显示了两个年龄段健康人小脑中miR-199b-5p表达水平的方框图。MiR-199b-5p在年轻对照组的外植体中表现出较高的表达（Mann-Whitney试验，P（P） = 0.006). B） MiR-199b-5p高表达病例大多为M0P（P） = 0.001（皮尔逊卡方检验）。C） Kaplan-Meier生存率评估与miR-199b-5p表达水平较高（相对于中位数）（45例患者有可用的随访数据）。D） 通过实时PCR在5个未经处理或经5-Aza-C（DAC−/+）处理的MB细胞系中表达MiR-199b-5p；去甲基化在Med8a和UW228两种细胞系中诱导miR-199b-5p转录。E） miR-199b-5p和Notch通路之间的相互作用。M0和M+患者的miR-199b-5p表达水平不同，这可能是由表观遗传机制驱动的。左侧：在诱导miR-199b-5p表达的条件下（1），HES1水平降低，减轻对神经原性bHLHs的抑制（2）。这反过来促进了神经原性程序和增殖、SP和CD133+细胞的减少（3）。右侧：在miR-199b-5p表达较低的情况下，HES1水平较高（1），抑制神经前bHLH基因，从而增加增殖、SP和CD133+室扩大（4）。
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