Amplification-free Illumina sequencing-library preparation facilitates improved mapping and assembly of (G+C)-biased genomes

doi:10.1038/nmeth.1311

.2009年4月；6(4):291-5.

doi:10.1038/nmeth.1311。 Epub 2009年3月15日。

无扩增Illumina序列文库制备有助于改进（G+C）偏倚基因组的定位和组装

伊万卡·科萨雷瓦¹, 泽民宁, 迈克尔·A·鹌鹑, 曼迪·J·桑德斯, 马修·贝里曼, 丹尼尔·透纳

附属公司

PMID： 19287394
预防性维修识别码：项目经理2664327
内政部： 10.1038/nmeth.111

无扩增Illumina序列文库制备有助于改进（G+C）偏倚基因组的定位和组装

伊万卡·科萨雷瓦等。 Nat方法. 2009年4月.

.2009年4月；6(4):291-5.

doi:10.1038/nmeth.1311。 Epub 2009年3月15日。

作者

伊万卡·科萨雷瓦¹, 泽民宁, 迈克尔·A·鹌鹑, 曼迪·J·桑德斯, 马修·贝里曼, 丹尼尔·透纳

附属

¹威康信托桑格研究所，威康信托基因组校园，英国剑桥Hinxton。

PMID： 19287394
预防性维修识别码：项目经理2664327
内政部： 10.1038/nmeth.111

摘要

在Illumina Genome Analyzer的文库准备过程中引入的扩增伪影增加了这些序列中相当大比例重复的可能性，并导致目标测序区域的读取覆盖率分布不均匀。因此，这些不利特征导致基因组组装和短读变异分析困难，特别是当序列来自碱基组成处于高或低G+C含量极端的基因组时。在这里，我们提出了一种无扩增的文库制备方法，其中簇扩增步骤而不是PCR，丰富了完全连接的模板链，减少了重复序列的发生率，改进了读取映射和单核苷酸多态性调用，并有助于重新组装。我们通过生成和分析极贫（G+C）（恶性疟原虫）、中性（大肠杆菌）和富（G+C）（百日咳杆菌）基因组的DNA序列来说明这一点。

PubMed免责声明

数字

**图1。No-PCR文库准备**
在标准和非PCR文库准备中，带有3′T外伸的部分互补（“Y”形）适配器被连接到片段化的末端修复的3′a尾DNA上。尽管标准适配器仅由读1和读2测序引物杂交的片段（R1和R2′）组成，但没有PCR适配器也包含有助于与附着在流动细胞表面的寡核苷酸杂交的序列（FP1和FP2′）。标准的文库准备使用PCR来添加这些片段，并对完全连接的模板进行富集，然后在流动细胞表面进行扩增。在无PCR方法中，流动池本身用于选择完全连接的模板分子。所有非PCR模板都以相同方向与流动细胞杂交，因为只有FP2′序列与流动细胞寡核苷酸反向互补。

**图2。基因组序列覆盖率分布**
对于带有（STD）或不带有（NP）PCR步骤的各种数据集，显示了序列覆盖率在未屏蔽基因组中的分布。(一)未屏蔽基因组相对于基因组基础覆盖深度的百分比(b条)疟疾株基因组基础覆盖深度对应的未屏蔽基因组累计百分比(*恶性疟原虫*（PF）2，3，88和85和3D7），具有长（L）或短（S）读数。(**c（c）**)未屏蔽基因组相对于基因组基础覆盖深度的百分比(d日)相对于基因组基础覆盖深度，未屏蔽基因组的累计百分比*大肠杆菌*042和*百日咳鲍特菌*ST24型

**图3。不同GC含量值的顺序读取分布**
疟疾菌株NP-3D7-S和STD-PF2的原始序列数据和映射序列数据的GC图谱与模拟数据（“Shred-3D7”）一起显示，以进行比较。GC级别是在读取长度的窗口大小中计算的，因此分数读取的峰值取决于读取长度。STD-PF2序列数据明显偏离模拟数据曲线，转向更平衡的GC成分，这表明存在严重偏差。

**图4。重复序列的频率**
从带有或不带有PCR步骤的库中导出的序列数据的匹配读取与重复深度的百分比。(一)重复频率*疟原虫*图书馆；(b条)复制频率*大肠杆菌*和*百日咳鲍特菌*库。

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