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.2009年5月；37(8):2658-71.
doi:10.1093/nar/gkp123。 Epub 2009年3月6日。

RNA-结合蛋白HuR通过稳定DNMT3b mRNA调节DNA甲基化

伊莎贝尔·洛佩斯·德西兰斯 1, Myriam Gorospe公司, 谷口弘一, 科特布·阿卜杜勒莫森, Subramanya Srikatan公司, 米格尔·阿拉米诺斯, 玛丽亚·贝尔达斯科, 罗西奥·G·乌尔丁圭奥, 马里奥·F·弗拉加, 菲利佩·V·哈辛托, 曼内尔·埃斯特勒
附属公司

RNA结合蛋白HuR通过DNMT3b mRNA的稳定调节DNA甲基化

伊莎贝尔·洛佩斯·德西兰斯等。 核酸研究. 2009年5月.

摘要

人类癌症中异常DNA甲基化模式的分子基础基本上尚不清楚。DNA甲基转移酶（DNMT）活性的改变被认为有助于肿瘤发生，因为DNMT表达水平在肿瘤发生过程中增加。在此，我们提供证据表明，DNMT3b的表达是由HuR转录后调节的，HuR是一种稳定和/或调节靶mRNA翻译的RNA结合蛋白。DNMT3b 3’UTR中假定的HuR识别基序的存在促使研究该转录物是否与HuR相关。通过内源性HuR核糖核蛋白复合物的免疫沉淀、DNMT3b mRNA的RT-qPCR检测、生物素化DNMT3bRNA的体外下拉以及HuR的western blotting检测来研究HuR和DNMT3bmRNA之间的相互作用。这些研究表明，结合HuR可以稳定DNMT3b mRNA并增加DNMT3b的表达。出乎意料的是，顺铂治疗触发了[HuR-DNMT3b mRNA]复合物的解离，反过来又促进了DNMT3b mRNA的衰变，降低了DNMT2b的丰度，降低了重复序列的甲基化和整体DNA甲基化。总之，我们的数据确定DNMT3b mRNA是一个新的HuR靶点，提供了HuR在转录后影响DNMT3b表达水平的证据，并揭示了HuR调节的DNMT3bDNA甲基化模式的功能后果。

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数字

图1。
图1。
HuR与内源性DNMT3b mRNA相关(A类)DNMT3b基因的四个选择性剪接转录变体。(B类)DNMT3b 3′UTR显示一个预测的HuR基序命中。(C类)siRNA转染后两天，收获RKO细胞进行蛋白质印迹分析，以监测HuR和负载对照α-微管蛋白的表达。(D类)用对照（C）或HuR siRNA转染RKO细胞，裂解产物用于使用抗HuR抗体或对照IgG1的IP反应；随后分离RNA并用于RT反应（插图）。溴化乙锭染色琼脂糖凝胶中所有DNMT3b变异体的代表性PCR产物；GAPDH（一种不是HuR靶点的内务信使核糖核酸）的水平用于验证相等的样品输入。（图）通过RT-qPCR分析测量的HuR IP与IgG IP中DNMT3b变体3 mRNA丰度的倍数差异。给出了三个独立实验的平均值（SEM）的平均值和标准误差(**P（P）≤ 0.01).
图2。
图2。
HuR员工在体外DNMT3b mRNA。生物素下拉分析中使用的DNMT3b-生物素化转录物[CR，CR片段（A和B），整个3′UTR（FL），部分3′UTR]的示意图。western blotting检测下拉材料中是否存在HuR；生物素化GAPDH 3′UTR作为阴性对照。星星代表HuR图案的位置。
图3。
图3。
HuR沉默降低了DNMT3b mRNA的稳定性和mRNA水平。(A类)siRNA转染两天后，采集RKO细胞，用RT-qPCR分析RNA（显示为三个实验的平均值±SEM*P（P）≤ 0.05). (B类)通过用放线菌素D孵育细胞，在所示时间提取总RNA，并通过RT-PCR测量DNMT3b mRNA水平，研究沉默HuR后DNMT3bmRNA的稳定性。显示了溴化乙锭染色琼脂糖凝胶中显示的所有DNMT3b变体的代表性PCR产物；GAPDH水平用于验证相等的样本输入。(C类)用RT-qPCR测定DNMT3b变异体3 mRNA水平。将数据标准化为18S（内务管理）mRNA水平，并使用半对数量表表示为在添加放线菌素D之前在时间0测量的mRNA水平的百分比。半衰期（指示）是指DNMT3b变异体3 mRNA减少到其初始丰度的50%所需的时间（不连续水平线）。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。
图4。
图4。
顺铂治疗降低DNMT3b mRNA的稳定性和稳态水平。(A类)siRNA转染后2天，用50μM顺铂处理细胞8 h，分离RNA并进行RT-qPCR（显示为三个实验的平均值±SEM*P（P）≤ 0.05); 将数据归一化为GAPDH。(B类)转染C siRNA的RKO细胞中DNMT3b变异体3和管家GAPDH mRNA的半衰期（参见补充图1对于HuR siRNA细胞），未经处理或用顺铂（50μM）处理，通过使用RT–qPCR进行定量，并如图3B的图例所述进行计算；数据表示三个独立实验的平均值±SEM。
图5。
图5。
顺铂治疗降低[HuR-DNMT3b mRNA]复合物。使用在指定时间从未经处理或顺铂处理的RKO细胞（50μM）制备的裂解物进行带有抗HuR或IgG抗体的IP；分离RNA进行RT-qPCR分析，检测DNMT3b变异体3 mRNA、GAPDH mRNA（背景结合的内务控制）和其他HuR靶mRNA（显示为三个实验的平均值±SEM*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.01).
图6。
图6。
HuR水平和顺铂治疗会影响携带DNMT3b 3′UTR的报告结构的活性。siRNA转染两天后，将含有DNMT3b 3′UTR（pMIR-3′UTRs）或GAPDH 3′UTR-（pMIR-GAPDH）的表达载体pMIR-report（萤火虫荧光素酶报告系统）与pGL4-Renilla瞬时共转染RKO细胞（用于转染效率的正常化）；24小时后，用顺铂（50μM，8小时）处理细胞，收集蛋白质和RNA。(A类)蛋白质提取物用于检测萤火虫和肾小球荧光素酶的活性。图显示肾细胞活性正常化后，pMIR-DNMT3b转染组中萤火虫荧光素酶活性相对于pMIR-GAPDH的相对增加倍数。数值代表三个独立实验的平均值±SEM(*P（P）≤ 0.05). (B类)用逆转录RNA对报告基因DNMT3b 3′UTR-荧光素酶mRNA相对于GAPDH 3′UTR荧光素ase mRNA进行qPCR检测。将转染效率标准化为每个样本中存在的pMIR载体数量，并通过CMV启动子区的qPCR扩增进行量化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。
图7。
图7。
顺铂不会改变细胞质HuR水平。通过对RKO细胞进行western blot分析来评估核质HuR水平，这些细胞要么未经治疗，要么接受50μM顺铂治疗。α-管蛋白和核仁蛋白信号分别用于显示细胞质和核组分的制备质量。
图8。
图8。
HuR沉默和顺铂治疗影响全局DNA甲基化和特定DNMT3靶DNA序列的甲基化。siRNA转染两天后，用25μM顺铂处理细胞24小时，提取DNA以测定(A类)高效液相色谱-质谱联用检测DNA甲基化(*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤0.01）和(B类)通过亚硫酸氢盐序列测定重复序列D4Z4和Sat2的DNA甲基化状态。黑色和白色方块分别表示甲基化或非甲基化CpG(*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.01).
图9。
图9。
DNMT3b沉默对特定DNMT3b靶DNA序列的全局DNA甲基化和甲基化的影响。(A类)在用所示的siRNA转染后两天，收获细胞，通过RT-PCR和琼脂糖凝胶中的可视化检查DNMT3b mRNA水平的降低；GAPDH用于显示样本输入的均匀度。按照（A）中的说明转染细胞，用25μM顺铂进一步处理24小时，提取DNA以测量(B类)高效液相色谱-质谱联用检测DNA甲基化(*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤0.01）和(C类)通过亚硫酸氢盐序列测定重复序列D4Z4和Sat2的DNA甲基化状态。黑色和白色方块分别表示甲基化或非甲基化CpG(*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.01).
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    1. Reik W.哺乳动物发育中表观遗传基因调控的稳定性和灵活性。自然。2007年；447:425–432.-公共医学
    1. Robertson KD。DNA甲基化与人类疾病。Nat.Rev.基因。2005;6:597–610.-公共医学
    1. 范伯格美联社。人类疾病的表型可塑性和表观遗传学。自然。2007年；447:433–440.-公共医学
    1. 埃斯特勒·M·表观遗传学与癌症。北英格兰。《医学杂志》，2008年；358:1148–1159.-公共医学
    1. 罗伯逊KD。DNA甲基化、甲基转移酶和癌症。致癌物。2001;20:3139–3155.-公共医学

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