Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors

doi:10.1016/j.cell.2009.02.013

.2009年3月6日；136(5):964-77.

doi:10.1016/j.cell.2009.02.013。

帕金森病患者来源的不含病毒重编程因子的诱导多能干细胞

弗兰克·索尔德纳¹, 德克·霍克梅耶, 卡罗琳·比尔德, 青高, 乔治·W·贝尔, 伊丽莎白·G·库克, 冈纳·哈格斯, 亚历山德拉·布莱克, 奥利弗·库珀, 迈萨姆·米塔利波娃, 艾萨克森, 鲁道夫·杰尼什

附属公司

PMID： 19269371
预防性维修识别码：项目经理2787236
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2009.02.013

无病毒重编程因子的帕金森病患者源性诱导多能干细胞

弗兰克·索尔德纳等。单元格. 2009.

.2009年3月6日；136(5):964-77.

doi:10.1016/j.cell.2009.02.013。

作者

附属

¹怀特黑德研究所，剑桥中心，马萨诸塞州，邮编：02142。

PMID： 19269371
预防性维修识别码：项目经理2787236
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2009.02.013

摘要

从患者体细胞中提取的诱导多能干细胞（iPSCs）是生物医学研究的有力工具，可能为替代疗法提供来源。然而，使用编码重编程因子的病毒是当前技术的一个主要限制，因为即使低载体表达也可能改变iPSCs的分化潜能或诱导恶性转化。在这里，我们发现来自五名特发性帕金森病患者的成纤维细胞可以有效地重新编程，并随后分化为多巴胺能神经元。此外，我们使用Cre-rebusise可激活病毒获得了无重编程因子的hiPSC。无因子hiPSC保持多功能状态，并显示出全局基因表达谱，与hESCs的关系比与携带转基因的hiPSC的关系更密切。我们的结果表明，携带病毒的hiPSC中残留的转基因表达会影响其分子特性，因此无因子hiPSC是更适合人类疾病建模的细胞来源。

PubMed免责声明

数字

**图1。帕金森病患者成纤维细胞来源的DOX-诱导hiPSC的特征**
（A） hiPSC株M的相衬图和免疫荧光染色^第三层-1（非PD hiPSC），PDA^第三层-1、PDB^第三层-5、PDC^第三层-1、PDD^第三层-1和PDE^第三层-3代表多能性标记SSEA4、Tra-1-60、OCT4、SOX2和NANOG。（B）内源性多潜能相关基因活化的定量RT-PCRNANOG公司,*华侨城4号*、和*SOX2标准*在所示的hiPSC系、hESCs和原代成纤维细胞中。相对表达水平标准化为成纤维细胞中这些基因的表达。（C）甲基化分析*华侨城4号*启动子区。浅灰色方块表示未甲基化和黑色方块甲基化的CpG华侨城4号hiPSCs启动子和亲代原代成纤维细胞。

**图2。帕金森病患者衍生的hiPSC携带低拷贝数的病毒整合**
（A） hiPSC株A6（非PD hiPSCs）、PDA产生的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色^第三层-1、PDB^第三层-1、PDC^3英尺-1、PDD^第三层-1和PDE^第三层-3显示：顶行面板，色素神经上皮；第二排面板，神经玫瑰花结；第三排板，肠上皮；第四排板，骨/软骨；和最底层的面板，平滑肌。（B）人胚胎干细胞系BG01、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞和PD患者衍生的hiPSC（和非PD hiPSC系M）的Southern blot分析^第三层-1）用于XbaI消化基因组DNA与³²P标记的DNA探针*华侨城4号*,*KLF4型*,*SOX2标准*、和*c-MYC公司*（C）基于（B）所示的Southern blot分析的hiPSC中四个重编程因子前病毒整合的近似数量汇总表。

**图3。PD患者特异性hiPSC产生多巴胺能神经元**
（A）人胚胎干细胞系BG01非PD型hiPSCs M神经元培养物的免疫荧光染色^第三层-1，以及指示的PD患者特异性hiPSC的神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；绿色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；红色）。神经细胞培养采用基于胚胎体（EB）的分化方案。（B）来源于hESC系H9、非PD hiPSCs A6和指示的PD患者特异性hiPSCs的神经元培养物的免疫荧光染色，用于神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；红色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；绿色）。神经细胞培养采用基于基质细胞共培养的方案。（C） hESCs（BG02，H9）、非PD hiPSC（iPS A6，M）神经元分化后TUJ1阳性神经元（左图）和TH阳性多巴胺能神经元（右图）的定量^第三层-2）并使用基于基质细胞共培养的方案（如[B]所示）显示PD患者特异性hiPSC。图表显示染色阳性的细胞相对于核Hoechst染色的百分比。误差条表示同一实验的三倍生成的SEM。

**图4。用loxP-可激活重编程因子产生帕金森病患者衍生hiPSC**
（A） DOX诱导的慢病毒构建物FUW-tetO-loxP和前病毒整合（2lox）和Cre-rewibase-mediated切除（1lox）后的基因组位点示意图。FUW-TetO-loxP矢量包含*四环素反应元件*(特雷)位于最小CMV启动子的5′和用于诊断Southern印迹消化的唯一MfeI位点。重编程因子的两侧是EcoRI限制性位点。该慢病毒载体的3′LTR包含一个loxP位点，该位点在前病毒复制到5′LTR的过程中被复制。在前病毒（2lox）基因组整合后，该复制导致转基因两侧有两个loxP位点。这允许将转基因与Cre-rewise（1lox）的完整启动子序列结合起来切除。（WRE，土拨鼠反应元件。）（B）hiPSC品系PDB的相位对比图和免疫荧光染色^2个液氧-17和PDB^2个液氧-21代表多能性标记SSEA4、Tra-1-60、OCT4、SOX2和NANOG。PDB公司^2个液氧-17和PDB^2个液氧-21是通过表达（A）中所示的FUW-tetO-loxP病毒的三个重编程因子OCT4、SOX2和KLF4而获得的。在这些细胞中，所有三个重编程因子的基因组整合位点两侧都有loxP位点。（C） PDB生成的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色^2个液氧-17和PDB^2个液氧-21个携带可激活重编程因子的细胞。

**图5。无因子重组hiPSC的产生与表征**
（A） Cre介导的切除转基因以产生无因子重组hiPSC的示意图概述。IPS-PDB公司^2个液氧用FUW-tetO-loxP慢病毒载体转化三种重编程因子获得细胞，*华侨城4号*,*KLF4型*、和*SOX2标准*（B）亲代成纤维细胞（PDB）前病毒整合的Southern blot分析^2个液氧克隆（PDB^2个液氧-17和PDB^2个液氧-21）和所指示的PDB^1个经Cre重组介导的转基因切除后的克隆。Puro表示PDB^1个通过嘌呤霉素筛选得到的克隆；GFP表示PDB^1个通过EGFP的FACS排序分离出的克隆（如[A]所示）。用XbaI消化基因组DNA，并使用³²P标记的DNA探针*华侨城4号*,*KLF4型*、和*SOX2标准*.PDB（PDB）^1个由于基于图S5所示MfeI摘要的剩余转基因整合，蓝色显示的克隆被忽略。（C） hiPSC品系PDB的细胞遗传学分析^1个-17Puro-5和PDB^1个-21Puro-12在Cre介导的转基因切除后显示正常核型。（D）无因子hiPSC生成的总结。

**图6。无因子重组hiPSC的特性**
（A）重组无因子hiPSC细胞系PDB的相位对比图和免疫荧光染色^1个-17Puro-5和PDB^1个-21Puro-12用于多能性标记SSEA4、Tra-1-60、OCT4、SOX2和NANOG。（B）定量RT-PCR检测内源性多能性相关基因的再激活*NANOG公司*,*华侨城4号*、和*SOX2标准*在人胚胎干细胞、成纤维细胞（PDB）、前病毒携带者PDB^2个液氧克隆（PDB^2个液氧-17和PDB^2个液氧-21）和指示的PDB^1箱经Cre重组介导的转基因切除后的克隆。相对表达水平标准化为成纤维细胞中这些基因的表达。（C）无因子PDB产生的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色^1个-17puro-5和PDB^1箱-21puro-26细胞。（D）无因子PDB神经细胞培养物的免疫荧光染色^1个-17puro-31和PDB^1个-21puro-13 hiPSCs用于神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1；绿色）和多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH；红色）。神经细胞培养采用基于胚胎体（EB）的分化方案。（E）定量RT-PCR检测转基因残余表达*华侨城4号*,*KLF4型*、和*SOX2标准*在人胚胎干细胞（BG01）、原代成纤维细胞（PDB）、原发感染成纤维细胞^第三层±DOX），hiPSC（M3^第三层-1）、PD-衍生hiPSC（PDA^第三层-1、PDB^第三层-5、PDC^第三层-1、PDD^第三层-1、PDE^第三层-3），前病毒携带者PDB^2箱克隆（PDB^2个液氧-17和PDB^2个液氧-21）和重新编程无因子PDB^1个克隆（PDB^1个-17采购订单-5，PDB^1个-17Puro-31，PDB公司^1个-21采购-12，PDB^1个-第21卷第20页）。相对表达水平归一化为DOX诱导的原发感染成纤维细胞表达。（F） hESCs（BG01，H9）和因子相关PDB基因表达谱的比较^2个液氧线路（PDB^2个液氧-5、PDB^2个液氧-17，PDB^2个液氧-21，PDB^2个液氧-22）和无工厂PDB^1个线路（PDB^1个-17Puro-5，PDB^1个-17Puro-10，PDB^1个-21普鲁-20，PDB^1个-21采购-26）。所有在无因子hiPSCs和携带因子的hiPSCs细胞之间表现出至少2倍差异表达的基因（n=1434）都按这个比例排序，并按样本进行分级聚类（使用非中心相关性和平均连锁）。所有log2比率都与成纤维细胞的表达有关。树状图中显示的数字表明了集群之间的皮尔逊相关性。经Fisher’s Z变换检测，无因子hiPSCs的表达谱与人胚胎干细胞的相关性高于因子相关hiPSC的表达谱（p<1e-7）。通过多尺度bootstrap重采样计算层次聚类的置信度，在hESCs和所有无因子PDB之间生成99%以上的聚类^1个行。（G）显示前病毒携带者PDB之间差异表达基因数量的维恩图^2个液氧线路（PDB^2箱-5、PDB^2个液氧-17，PDB^2个液氧-21，PDB^2箱-22）与hESCs（H9，BG01）相比，或重新编程无因子PDB^1头牛线路（PDB^1个-17Puro-5，PDB^1个-17Puro-10，PDB^1个-21普鲁-20，PDB^1个-21Puro-26）分别与人胚胎干细胞（H9，BG01）进行比较。

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1. Aasen T、Raya A、Barrero MJ、Garreta E、Consiglio A、Gonzalez F、Vassena R、Bilic J、Pekarik V、Tibriviia G等。从人类角质形成细胞高效快速地生成诱导的多能干细胞。国家生物技术。2008;26:1276–1284.-公共医学
1. Allen JD，Berns A.基因敲除小鼠中合作癌基因的互补标记。塞明癌症生物学。1996;7:299–306.-公共医学
1. Brambrink T、Foreman R、Welstead GG、Lengner CJ、Wernig M、Suh H、Jaenisch R。小鼠体细胞直接重编程期间多能性标记的顺序表达。细胞干细胞。2008;2:151–159.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Carey BW、Markoulaki S、Hanna J、Saha K、Gao Q、Mitalipova M、Jaenisch R.使用单个多顺反子载体对小鼠和人类体细胞进行重新编程。美国国家科学院院刊2009；106:157–162.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Costa M、Dottori M、Sourris K、Jamshidi P、Hatzistavrou T、Davis R、Azzola L、Jackson S、Lim SM、Pera M等。使用电穿孔对人类胚胎干细胞进行基因改造的方法。Nat协议。2007;2:792–796.-公共医学

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[1] Aasen T、Raya A、Barrero MJ、Garreta E、Consiglio A、Gonzalez F、Vassena R、Bilic J、Pekarik V、Tibriviia G等。从人类角质形成细胞高效快速地生成诱导的多能干细胞。国家生物技术。2008;26:1276–1284.-公共医学

[2] Aasen T、Raya A、Barrero MJ、Garreta E、Consiglio A、Gonzalez F、Vassena R、Bilic J、Pekarik V、Tibriviia G等。从人类角质形成细胞高效快速地生成诱导的多能干细胞。国家生物技术。2008;26:1276–1284.-公共医学

[3] Allen JD，Berns A.基因敲除小鼠中合作癌基因的互补标记。塞明癌症生物学。1996;7:299–306.-公共医学

[4] Allen JD，Berns A.基因敲除小鼠中合作癌基因的互补标记。塞明癌症生物学。1996;7:299–306.-公共医学

[5] Brambrink T、Foreman R、Welstead GG、Lengner CJ、Wernig M、Suh H、Jaenisch R。小鼠体细胞直接重编程期间多能性标记的顺序表达。细胞干细胞。2008;2:151–159.-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Brambrink T、Foreman R、Welstead GG、Lengner CJ、Wernig M、Suh H、Jaenisch R。小鼠体细胞直接重编程期间多能性标记的顺序表达。细胞干细胞。2008;2:151–159.-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Carey BW、Markoulaki S、Hanna J、Saha K、Gao Q、Mitalipova M、Jaenisch R.使用单个多顺反子载体对小鼠和人类体细胞进行重新编程。美国国家科学院院刊2009；106:157–162.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Carey BW、Markoulaki S、Hanna J、Saha K、Gao Q、Mitalipova M、Jaenisch R.使用单个多顺反子载体对小鼠和人类体细胞进行重新编程。美国国家科学院院刊2009；106:157–162.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Costa M、Dottori M、Sourris K、Jamshidi P、Hatzistavrou T、Davis R、Azzola L、Jackson S、Lim SM、Pera M等。使用电穿孔对人类胚胎干细胞进行基因改造的方法。Nat协议。2007;2:792–796.-公共医学

[10] Costa M、Dottori M、Sourris K、Jamshidi P、Hatzistavrou T、Davis R、Azzola L、Jackson S、Lim SM、Pera M等。使用电穿孔对人类胚胎干细胞进行基因改造的方法。Nat协议。2007;2:792–796.-公共医学

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