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.2009年2月23日；184(4):569-81.
doi:10.1083/jcb.200809099。

线粒体外膜和内膜融合需要改良的载体蛋白

苏珊·霍平斯 1, 詹妮弗·霍纳, 程松, J迈克尔·麦卡弗里, 乔迪·努纳里
附属公司

线粒体外膜和内膜融合需要改良的载体蛋白

苏珊·霍平斯等。 J细胞生物学. .

摘要

在酵母中，三种蛋白质对线粒体融合至关重要。Fzo1和Mgm1是分别位于外膜和内膜的保守的鸟苷三磷酸酶。在每个膜上，这些保守的蛋白质是膜栓系和脂质混合的不同步骤所必需的。第三个基本成分是Ugo1，线粒体转运蛋白家族中的一种外膜蛋白。我们证明Ugo1是该家族的一个修饰成员，包含三个跨膜结构域，并以二聚体的形式存在，二聚体是Ugo1融合功能的关键结构。我们对Ugo1的功能分析表明，在膜栓系后，无论是外膜融合还是内膜融合都需要Ugo1，这表明Ugo1在融合的脂质合成阶段起作用。这种作用不同于融合动力蛋白相关蛋白，因此表明在每个膜上，单个融合蛋白不足以驱动脂质合成步骤，但相反，这一步骤需要更复杂的蛋白质组装。

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数字

图1。
图1。
Ugo1拓扑分析。（A和B）在使用（+）或不使用（−）胰蛋白酶（1和6道）处理之前，线粒体保持完整（5和10道），转化为有丝分裂体（3和8道；有丝分裂上清液，4和9道），或溶解（2和7道），并用SDS-PAGE和免疫印迹法对所示抗血清进行分析。23-kD保护的C末端Ugo1片段用一个箭头表示，17-20-kD保护N末端片段用星号表示。双箭头表示二级抗体与胰蛋白酶（HRP-α兔子）的非特异性相互作用。（C） Ugo1结构示意图。黑框表示根据A中的数据预测为真实TMD的疏水区域，灰色框表示其他可能的TMD。氨基酸位置列在方框上方。预测细胞溶质（cyt）和IMS区域也显示出来。（D） 可能的Ugo1结构示意图。MP，有丝分裂体；MP sup，有丝分裂体上清液。N、 N终点；C、 C终点。
图2。
图2。
Ugo1包含三个跨膜结构域。（A） 如图1所示的Ugo1示意图，带有指示内部三重HA标签位置的箭头。（B） 对Ugo1的内部HA标记版本进行蛋白酶保护分析，如图A所示。受保护的C末端片段用星号表示。双箭头表示抗体与胰蛋白酶（IRdye-α兔子）的非特异性相互作用。（C） 线粒体外膜Ugo1拓扑模型。假定载体域的位置均用星号表示。MP，有丝分裂体；MP sup，有丝分裂体上清液。N、 N末端；C、 C终点。
图3。
图3。
天然Ugo1形成115-kD同源寡聚体，需要保守的ETM。（A） 从Δugo1+空载体或表达无人值守地面传感器1、Ugo1D134R型、Ugo1第137天、Ugo1D312R型，或Ugo1R315D型溶于1.5%洋地黄素中，通过hrCN-PAGE和Ugo1多克隆抗血清免疫检测进行分析。除了Ugo1物种（双箭头）外，血清检测到的少量非特异性条带在斑点上可见（单箭头）。（B） 用α-HA单克隆抗体（左）或α-Flag单克隆抗体，在125µg化学交联线粒体上进行免疫沉淀无人值守地面传感器1-标记应变或无人值守地面传感器1-表达Ugo1-HA的标记菌株。蛋白质通过SDS-PAGE和Western blotting和所示抗体进行分析。总量（T）占输入量的2.5%，颗粒（P）占免疫沉淀蛋白的25%。（C） 为了检测蛋白质稳定性，用SDS-PAGE分离A（10µg）中的洋地黄素固体线粒体，并用α-Ugo1或α-孔蛋白进行西方分析。该图表示通过SDS-PAGE分析检测到的归一化为孔蛋白的洋地黄素裂解物Ugo1总蛋白水平与通过hrCN-PAGE分析检测出的115-kD Ugo1物种中检测到的水平的定量。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）进行量化。
图4。
图4。
Ugo1的温度敏感等位基因的特征。（A） 野生型(无人值守地面传感器1和UGO1-哈)和ugo1型温度敏感电池(ugo1-1–ugo1-5)分别置于YPD和YPEG平板上，并在允许温度（23°C）或非允许温度（37°C）下培养。（B，顶部）体外内膜融合试验的示意图。（中）体外线粒体与线粒体融合反应的荧光图像无人值守地面传感器1和乌干达1-1箭头表示聚变事件。（底部）线粒体体外融合效率的比较无人值守地面传感器1,乌戈ts秒,fzo1-1型、和5毫克线粒体在允许温度（23°C）和非允许温度（37°C）下。的融合效率乌戈1ts秒线粒体表示为野生型融合的百分比，平均占线粒体总数的8.5%。数据表示为平均值±SEM。棒状物，1µm。
图5。
图5。
Ugo1是线粒体外膜和内膜融合所必需的。（A） 图示为体外线粒体外膜融合试验的示意图。该图比较了分离自无人值守地面传感器1,乌戈1ts秒,fzo1-1型、和5毫克菌株。这两类融合突变体分别由线粒体外膜（MOM）和线粒体内膜（MIM）融合缺陷的灰色和黑色条表示。三个独立实验平均值的绝对值（线粒体总百分比，n个>350）是无人值守地面传感器1, 5.2;乌干达1-1, 2.5;ugo1-2, 2.9;乌戈1-3, 3.2;ugo1-4, 5.3;8月1日至5日, 5.9;fzo1-1型, 2.4; 和5毫克, 4.9. （B） 在非允许温度下进行体外融合的样品中观察到的外膜融合线粒体的典型电子显微照片。该图比较了电子显微镜下观察到的外膜融合线粒体的丰度。线粒体是从无人值守地面传感器1,乌戈1ts秒,fzo1-1型、和5毫克菌株，并在非许可温度（37°C）下接受线粒体外膜（S1）体外融合条件。三个独立实验平均值的绝对值（线粒体总百分比，n个>350）是无人值守地面传感器1, 7;乌干达1-1, 3.3;ugo1-2, 3.2;8月1-3日, 2.7;ugo1-4, 7.9;8月1日至5日, 5.6;fzo1-1型, 0.8; 和5毫克, 7.5. 白色条显示野生型对照菌株。数据表示为平均值±SEM.Bar，0.5µm。
图6。
图6。
线粒体外膜融合中间产物的鉴定。（A） 外膜栓系分析.野生型（顶部）和ugo1-2（底部）线粒体在非允许温度下进行体外外膜融合。栓系的线粒体用箭头表示。（B） A中描述的分析中外膜系留线粒体的代表性图像。下面放大了方框区域。棒材：（顶部）0.5µm；和（底部）0.25µm。（C） 在存在非水解GTP类似物GMP-PCP的情况下，在S1体外融合条件下对野生型线粒体中Fzo1定位进行免疫电镜分析。箭头表示由两个线粒体、修饰的Fzo1特异性免疫金颗粒形成的外膜处的界面。（A和C）棒材，0.5µm。
图7。
图7。
线粒体外膜和内膜栓系效率的量化。（A） 在分离的线粒体中观察到的栓系线粒体丰度的比较无人值守地面传感器1,乌戈1ts秒、和fzo1-1型受S1体外融合条件影响的菌株。野生型线粒体也用非水解GTP衍生物PCP处理或用胰蛋白酶预处理，以在S1体外融合条件下去除外膜蛋白的细胞溶质部分。至少两个独立实验平均值的绝对值（线粒体总数的百分比，n个>350）是无人值守地面传感器1, 4.5;乌干达1-1, 7.9;ugo1-2, 6.3;8月1-3日, 6.3;ugo1-4, 5.3;8月1日至5日, 3.4;fzo1-1型, 8.4; PCP，6.3；胰蛋白酶化1.98。（B） 体外融合线粒体外膜融合结构中紧密内膜界面丰度的比较UGO1、UGO1-4、UGO1-15、和毫克1-10菌株。至少两个独立实验平均值的绝对值（线粒体总数的百分比，n个>350）是无人值守地面传感器1, 80;乌戈1-4, 100;8月1日至5日, 100; 和毫克1-10, 51. 白色条显示野生型对照菌株。线粒体外膜；线粒体内膜。数据表示为平均值±SEM。
图8。
图8。
有效的线粒体融合并不需要两个线粒体伴侣都使用Ugo1。显示了具有异源反应的体外内膜融合分析的示意图。该图显示了体外线粒体融合效率的比较无人值守地面传感器1×无人值守地面传感器1,无人值守地面传感器1×UGO1-HA型、和无人值守地面传感器1×乌戈1ts秒非允许温度（37°C）下的异源反应。三个独立实验的平均值的绝对值（线粒体总数的百分比，n个>350）是无人值守地面传感器1, 8.5;UGO1-HA型, 7.7;ugo1-1型, 4.6;ugo1-2, 5.5;8月1-3日, 4.3;ugo1-4, 6.6; 和8月1日至5日, 5.1. 白色条显示野生型对照菌株。MOM，线粒体外膜；线粒体内膜。数据表示为平均值±SEM。
图9。
图9。
Ugo1突变使二聚体不稳定。（A） Ugo1 115-kD物种的稳定性在乌戈1ts秒等位基因。线粒体分离自UGO1-HA型和乌戈1ts秒菌株在2%洋地黄素中溶解，用hrCN-PAGE和Ugo1多克隆抗血清进行Western分析。除了Ugo1物种（双箭头）外，在斑点上还可以看到少量非特异性条带（单箭头）。（B） 为了检测蛋白质稳定性，用SDS-PAGE分离A（10µg）中的洋地黄素固体线粒体，并用α-Ugo1或α-孔蛋白进行西方分析。该图表示通过SDS-PAGE分析检测到的归一化为孔蛋白的洋地黄素裂解物Ugo1蛋白的定量，与通过hrCN-PAGE分析检测到115-kD Ugo1物种中检测到的定量相比。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）进行量化。
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